红松种鳞多酚的分离纯化及抗肿瘤活性的研究

发布时间：2020-10-20 03:05

　　 红松种鳞为我国东北地区主要针叶树种红松的球果鳞片,一直以来鲜有利用,对于林区废弃物的高效利用,将其转化为具有高活性、高附加值的产品,具有一定的理论价值和社会意义。本研究以红松种鳞为研究对象,提取分离红松种鳞多酚化合物,并对其抑制肿瘤活性进行研究,结论如下:(1)将红松种鳞进行超临界脱脂,以乙醇为提取溶剂,采用研磨珠辅助法进行红松种鳞多酚的提取。研究液料比、提取时间、珠填充率、珠直径及转速五个因素对多酚得率的影响;在此基础上,以Plackett-Burman法析因,得到提取时间液料比珠填充率的主要影响因素排序;采用Box-Behnken响应面优化工艺,得到红松种鳞多酚最佳提取工艺为:液料比62:1,提取时间2.1h,珠填充量62%,在此提取工艺条件下,红松多酚得率为29.09 mg/g。(2)对红松种鳞多酚提取物进行大孔吸附树脂的初步分离纯化。以静态吸附率与解吸率为研究指标,筛选极性各异的七种大孔吸附树脂,得到AB-8为最佳分离介质;考察动态洗脱条件,并以正交优化,得到最佳纯化工艺为:70%的乙醇作为洗脱液,用量为4BV,分离柱径长比1:25,洗脱流速0.9 mL/min,在此纯化条件下,红松多酚纯度由11.56%提高至39.82%。经HPLC初步鉴定,红松多酚成分为槲皮素(35.86%)、对香豆酸(16.58%)、水杨酸(12.41%)、没食子酸(4.42%)、绿原酸(4.07%)、儿茶素(3.25%)、芦丁(3.]8%)、根皮苷(3.09%)、白藜芦醇、肉桂酸、咖啡酸、原花青素。(3)采用硅胶柱层析,选择乙酸乙酯、正丁醇、甲醇及水配置为不同极性梯度的溶剂,依次对红松种鳞多酚进行洗脱分离,多酚化合物各分离部位以A549肺腺肿瘤细胞的抑制率为活性跟踪指标,确定活性部位。共合并收集12个红松多酚分离部位,在0.2-1.4 mg/mL浓度范围内,通过对BEAS-2B肺上皮细胞的抑制率(CTE)考察,证实]2个多酚化合物的分离部位对于机体正常细胞均无毒性存在;对A549肿瘤细胞抑制效果最强的为正丁醇/甲醇(DJP)部位,与其它分离部位相比,抑制增殖效应呈现显著差异(尸0.05),该分离部位的HPLC结果表明,其中34.14%为槲皮素成分,31.27%为肉桂酸。该分离部位对于卵巢癌Hela、皮肤癌A375、结肠癌LoVo、肺腺癌A549离体细胞的增殖抑制均呈现显著的剂量效应关系(P0.05)。单细胞凝胶电泳结果表明,48h内对于A549肿瘤细胞DNA呈现持续破坏作用,0.4 mg/mL浓度作用24h时达到最强效应,Olive尾矩为28.14±9.64,TDNA%达到 59.44%;流式细胞术检测发现,红松多酚化合物将A549肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期。(4)建立荷瘤小鼠模型,以50、100、200 mg/kg.d剂量饲喂红松种鳞多酚化合物,结果表明,高剂量红松多酚的饲喂使抑瘤率达到62.23%,与环磷酰胺抗肿瘤药物的抑瘤作用无显著差异(P0.05);不同剂量的红松多酚均使得荷瘤鼠的免疫器官指数显著优于肿瘤模型组及抗肿瘤药物组;超敏试验(DTH)结果显示,高剂量红松多酚对于DTH有极显著抑制作用(PO.01),剂量递减时呈现抑制效应的递减,但未呈现显著差异(P0.05);脾细胞增殖抑制试验中,可见红松多酚与茶多酚均对脾细胞增殖有极显著促进作用(PO.W);高剂量红松多酚对碳粒廓清效果极显著,同样在高剂量饲喂水平组的血清TNF-α及IL-2含量亦显著高于肿瘤模型组(P0.05)。在小鼠机体氧化酶系的考察中发现,红松多酚对于小鼠肝、脑、肾组织中的T-SOD酶活有显著促进,同时显著降低MDA含量(P0.05);高剂量的红松多酚对CAT酶活有显著上调效应,对脑、肝组织中的GSH-Px酶活有提高,且显示出显著的剂效差异(PO.05)。(5)采用肿瘤组织的免疫组化技术结合形态学观察方法,对红松种鳞多酚抑瘤途径进行研究。通过HE染色后的形态学观察,可见不同剂量红松多酚的饲喂,对于肿瘤组织的细胞产生明显的损伤,单细胞凝胶电泳结果表明,红松多酚化合物可在72h内持续发挥作用,呈现剂量、时间的依赖关系(P0.05),Olive尾矩35.96士6.48,TNDA%达到71.12±9.82%,细胞周期被阻滞于G2/M期。TNUEL检测印证红松种鳞多酚对于肿瘤组织细胞凋亡的程度存在剂效趋势;Caspase-9及-Caspase 3在不同组别中极显著地呈现表达上的一致性(P0.0W),高剂量下红松多酚对于Caspase-9的表达极显著优于其它组别。SHH通路的Ptch-1及Gli-I两种基因蛋白表达呈现出显著的相关性,相关系数r=0.945,为极显著相关(P0.01),红松多酚对于两者的表达起到抑制作用,且呈现出显著下调的剂量效应关系;Notch信号通路的Notch-1及Hes蛋白被同时阳性检出,二者极显著相关,不同剂量的红松多酚作用下,Hes转录因子表现出显著下调的的效应关系(P0.05)。说明红松多酚极可能成为肿瘤细胞SHH通路及Notch信号通路的活性抑制剂。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284;R285
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 课题背景
    1.2 国内外相关研究现状及发展趋势
        1.2.1 多酚类化合物
        1.2.2 植物多酚的提取分离技术
        1.2.3 植物多酚抗肿瘤研究
    1.3 本研究内容
    1.4 本研究工艺路线
2 研磨珠法提取红松种鳞多酚工艺研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 试验方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 建立多酚标准曲线
        2.2.2 脱脂方案的确定
        2.2.3 单因素对红松种鳞多酚提取得率的影响
        2.2.4 Plackett-Burman法筛选红松种鳞多酚得率的显著影响因素
        2.2.5 Box-Behnken响应面优化红松种鳞多酚提取工艺
    2.3 讨论
    2.4 本章小结
3 红松种鳞多酚纯化最佳工艺参数的优化
    3.1 材料与方法
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 试验方法
    3.2 结果与分析
        3.2.1 固相介质的筛选
        3.2.2 静态吸附条件的确定
        3.2.3 动态洗脱单因素试验
        3.2.4 正交优化动态洗脱条件
        3.2.5 红松种鳞多酚化合物的组分分析
    3.3 讨论
    3.4 本章小结
4 红松种鳞多酚的活性部位分离及对肿瘤细胞的活性跟踪
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 试验方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 硅胶柱层析分级红松种鳞多酚
        4.2.2 红松多酚不同分级部位对BEAS-2B肺上皮细胞的细胞毒作用
        4.2.3 红松种鳞多酚不同分级部位对A549肺腺肿瘤细胞的抑制作用
        4.2.4 红松种鳞多酚(DJP)对4种肿瘤细胞抑制的剂量、时间依赖关系
        4.2.5 单细胞凝胶电泳评价红松种鳞多酚对A549肿瘤细胞的DNA损伤
        4.2.6 流式细胞术检测红松种鳞多酚诱导A549肿瘤细胞凋亡
    4.3 讨论
    4.4 本章小结
5 红松种鳞多酚对荷瘤小鼠生理功能的影响
    5.1 材料与方法
        5.1.1 试验材料
        5.1.2 试验方法
    5.2 结果与分析
        5.2.1 荷瘤鼠的生长状况
        5.2.2 小鼠的体重变化曲线
        5.2.3 红松种鳞多酚对荷瘤鼠的抑瘤率
        5.2.4 红松多酚对荷瘤鼠免疫器官指数的影响
        5.2.5 红松多酚对荷瘤小鼠外周血指标的影响
        5.2.6 红松多酚对荷瘤鼠迟发型超敏反应(DTH)的影响
        5.2.7 红松种鳞多酚对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
        5.2.8 小鼠的碳粒廓清作用
        5.2.9 红松种鳞多酚对荷瘤鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响
        5.2.10 红松多酚对荷瘤小鼠血清中白细胞介素(IL-2)的影响
        5.2.11 荷瘤鼠体内总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力的变化
        5.2.12 荷瘤鼠体内丙二醛(MDA)含量的变化
        5.2.13 荷瘤鼠体内谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-P_x)活力的变化
        5.2.14 荷瘤鼠体内过氧化氢酶(CAT)活力的变化
    5.3 讨论
    5.4 本章小结
6 红松种鳞多酚对肿瘤抑制的机制研究
    6.1 材料与方法
        6.1.1 试验材料
        6.1.2 试验方法
    6.2 结果与分析
        6.2.1 HE染色结果
        6.2.2 TUNEL法检测细胞凋亡
        6.2.3 Caspase-9及/Caspase-3的表达
        6.2.4 红松多酚对SHH信号通路Ptch-1、Gli-1的表达影响
        6.2.5 红松多酚对Notch信号通路Notch-1、Hes的表达影响
    6.3 讨论
    6.4 本章小结
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢

【参考文献】

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本文编号：2848115