绞股蓝皂苷治疗大鼠视神经损伤、视网膜炎相关机制的实验研究

发布时间：2020-10-20 10:24

　　 研究背景视神经炎(Optic neuritis)是一种可导致视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cell,RGC)缺失和视力障碍的常见视神经病变,其主要的病理变化为视神经炎症反应、脱髓鞘和RGCs损伤。视神经炎的病因复杂,可以是原发性视神经炎,也可以是由自身免疫性疾病或感染导致。视神经炎可造成1-2周内视力急剧下降,部分患者1-3个月内可自行恢复,然而仍有大约半数的患者会遗留不同程度的永久性视觉功能障碍。目前,视神经炎的治疗主要运用糖皮质固醇类药物。然而此类药物不能预防视神经轴索损伤,因而无法改善视神经炎病程中对RGC和视觉功能的损害。因此,探索具有视神经节细胞保护功能的药物对视神经炎治疗具有重要意义。绞股蓝皂苷(Gypenosides,GPs)是传统中药材葫芦科植物绞股蓝的总皂苷,研究显示GPs具有抗炎作用及对神经变性疾病发挥保护作用,提示绞股蓝皂苷亦可能对视神经炎、视神经细胞发挥保护作用。本实验通过建立大鼠视神经视网膜炎模型及NMDA诱导的RGC-5细胞兴奋性毒性模型的研究,评估GPs对视神经炎的治疗效果以及对视神经节细胞的保护作用,并对可能的分子机制进行研究。第一部分 绞股蓝皂苷对视神经炎损伤模型大鼠视神经及视网膜的保护作用目的视神经炎是一种常见的视神经损伤病变,视神经任何部位发生的炎症的总称。分为原发性视神经炎症、非特异性炎症和视神经轴突损伤,最终可导致视网膜神经节细胞(RGCs)缺失和视力障碍。本研究中通过向视神经髓鞘内注射脂多糖(LPS)建立视神经炎损伤模型,观察绞股蓝皂甙(GPs)对视神经组织及视网膜RGCs损伤后的保护作用。方法Sprague Dawley大鼠视神经微量注射LPS诱导视神经炎,造大鼠视神经损伤、视网膜炎模型,实验动物随机分为对照组、视神经炎组(ON)、ON+GPs组。视神经炎组(ON)、ON+GPs组,观察每组HE染色组织病理变化,免疫荧光检测ED1/CD68、GFAP的表达情况,视神经损伤情况应用勒克斯坚牢蓝(LFB)染色法评估视神经的髓鞘脱失程度,TUNEL检测视网膜细胞凋亡情况。结果1.GPs减轻视神经炎损伤模型大鼠的视神经损伤程度;2.GPs抑制视神经和视网膜中由LPS诱导的巨噬细胞和星形胶质细胞的增加;3.GPs缓解LPS诱导的视网膜RGC损伤。结论目前的研究表明GPs显著减弱LPS诱导神经炎症反应介导的视神经组织及视网膜损伤,抑制巨噬细胞激活、星形胶质细胞增生,发挥对脱髓鞘和RGC的保护作用。GPs可以作为视神经损伤治疗药物。第二部分绞股蓝皂苷对视神经炎炎症因子表达及相关抗炎机制探讨目的外伤或炎症引起的视神经的损伤,都会表现为炎症反应的激活,释放大量炎症因子,加剧神经损伤状况。促炎性细胞因子TNF-α和IL-6,以及炎症相关酶COX2和iNOS都参与视神经炎症反应的发生发展过程,NF-κB和STAT是两种重要的炎症信号通路;本研究中我们检测促炎细胞因子TNF-α、IL-6、COX2和iNOS的表达及炎症信号NF-κB和STAT的表达变化,进一步探讨GPs发挥作用的可能机制。方法Sprague Dawley大鼠视神经微量注射LPS诱导视神经炎,造大鼠视神经视网膜炎模型,实验动物随机分为对照组、视神经炎组(ON)、ON+GPs组。视神经炎组(ON)、ON+GPs组,取新鲜组织每组Real-time PCR法检测相关基因表达的差异,Western blot检测相关蛋白的表达差异。结果1.GPs抑制LPS诱导的视神经炎大鼠视神经损伤模型中促炎细胞因子TNF-α 和 IL-6、COX2 和 iNOS 的表达;2.GPs抑制LPS诱导的视神经炎大鼠视神经损伤模型中STAT1,STAT3和NF-κB通路的活化。结论GPs显著减弱LPS诱导的促炎细胞因子TNF-α、IL-6和炎症相关酶COX2、iNOS的表达,小胶质细胞激活,星形胶质细胞增生,脱髓鞘和RGC损失。这些作用可能与抑制NF-κB和STAT信号通路有关。第三部分 绞股蓝皂苷对NMDA诱导的RGC-5细胞兴奋性毒性的保护作用研究目的视神经损伤的病理基础是视网膜神经节细胞(RGCs)的进行性死亡和视神经纤维的丢失,从而导致视功能发生不可逆性改变。许多N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂已被用于治疗由临床中谷氨酸兴奋毒性引起的神经退行性疾病。检测在体外的条件下,绞股蓝皂苷对NMDA诱导的RGC-5细胞的作用机理。方法NMDA(400 μM)处理RGC-5细胞建立神经兴奋性毒性损伤模型,进而细胞培养、传代、计数、冻存、给药,待用。Annexin V-FITC-PI染色流式细胞术检测细胞凋亡,Real-time PCR检测相关基因表达,ELISA检测相关炎性因子表达。结果1.GPs抑制NMDA诱导的RGC-5细胞兴奋性毒性;2.GPs抑制NMDA诱导的RGC-5细胞炎症因子表达;3.GPs可能通过基因表达水平抑制炎症因子表达,发挥对RGC-5细胞的护护作用。结论本研究得到GPs有效抑制NMDA诱导的RGCs细胞神经毒性的作用,并抑制炎症因子TNF-α,IL-6和INF-γ及促炎性酶COX2和iNOS的表达;提示GPs可能通过抑制炎症因子的表达拮抗NMDA诱导的RGCs细胞神经毒性。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

允由窬?姿鹕四Ｐ痛笫笫由窬?笆油?さ谋；ぷ饔茫崳?复正常，ＧＰｓ有效的减轻了视神经损伤的炎症表现（图１）。??在ＬＦＢ染色中，可明显观察到在ＬＰＳ诱导的视神经炎大鼠的视神经中发现??明显脱髓鞘现象；ＧＰｓ治疗有效减轻视神经脱髓鞘状况（图１）。表明ＧＰｓ对??ＬＰＳ诱导的视神经炎大鼠模型有较好的保护视神脱髓鞘修复的作用。??ｃｏｎ?ＬＰＳ?ＬＰＳ＋ＧＰｓ??－－，－：Ｘ?ｒ；＇：－＼－ｖ－＇?？??ＨＥ?＾－?■５?：：?＾：；：??ｍｍｍ??图１．?ＧＰｓ减轻ＬＰＳ诱导的视神经炎损伤模型大鼠视神经结构改变和脱髓鞘。Ｈ＆Ｅ染色（上??图）和ＬＦＢ染色（下图）评估视神经中的结构变化和脱髓鞘。比例尺：５０微米。??３．２?ＧＰｓ抑制视神经中由ＬＰＳ诱导的小胶质细胞／巨噬细胞和星形胶质细??胞的增加??通过免疫染色检测ＣＤ６８和ＧＦＡＰ的表达量，反应视神经中的小胶质细胞／??巨噬细胞和星形胶质细胞的数量。如图２所示，ＬＰＳ刺激组视神经中ＣＤ６８和??ＧＦＡＰ的荧光强度显著增加（Ｐ?＜０．０１对比ｃｏｎ）。治疗２１天的ＧＰｓ显著降低了??两种生物标志物的荧光强度（相对于ＬＰＳ，?Ｐ?＜０．０１）。表明，ＧＰｓ治疗有效减??少视神经炎性小胶质细胞／巨噔细胞和星形胶质细胞的富集，减缓炎症反应的发??生。??１６??

胞的增加??通过免疫染色检测ＣＤ６８和ＧＦＡＰ的表达量，反应视神经中的小胶质细胞／??巨噬细胞和星形胶质细胞的数量。如图２所示，ＬＰＳ刺激组视神经中ＣＤ６８和??ＧＦＡＰ的荧光强度显著增加（Ｐ?＜０．０１对比ｃｏｎ）。治疗２１天的ＧＰｓ显著降低了??两种生物标志物的荧光强度（相对于ＬＰＳ，?Ｐ?＜０．０１）。表明，ＧＰｓ治疗有效减??少视神经炎性小胶质细胞／巨噔细胞和星形胶质细胞的富集，减缓炎症反应的发??生。??１６??

３．３?ＧＰｓ缓解ＬＰＳ诱导的视网膜ＲＧＣ损伤??使用Ｈ＆Ｅ染色和Ｂｍ３ａ－ＴＵＮＥＬ双染色检查视网膜的组织学变化和ＲＧＣ损??伤。如图３所示，ＬＰＳ注射后总视网膜层厚度没有变化，但ＲＧＣｓ数量显著减少，??并且视网膜中的Ｂｍ３ａ－ＴＵＮＥＬ阳性细胞显著增加。ＧＰｓ治疗２１天扭转了这些变??化。表明ＧＰｓ对神经炎导致的视网膜ＲＧＣｓ损伤发挥保护作用。??Ａ??Ｈ＆Ｅ?Ｂｍ３ａ?ＴＵＮＥＬ?ＤＡＰＩ?Ｍｅｒｇｅ??ＬＰＳ?＝?ｒ?；Ｐ?Ｃ：…??，ｘ．．‘：＇??Ｂ??２００－．?＾?２５－ｉ?２?１０１?＊＊??Ｊｌ５０－?Ｉ２０－?ｐｎ?＂＃?ｉ?８．?工??§１〇〇．?ｉ１５－?＊＊?ｎ?！６?门＃??％?ｃ?１０．?ｒ１！?运?４．?，Ｘ??〇（／）－＊－＊??差?５〇?｜?５－?｜?２．?Ａ??〇?＃?°?一?Ｖ？％，＜。。。、？％，??图３视网膜结构和ＲＧＣ损失情况分析。（Ａ）视网膜切片的Ｈ＆Ｅ和Ｂｒｎ３ａ－ＴＵＮＥＬ双染色。??比例尺：５０微米。（Ｂ）视网膜厚度、ＲＧＣ数量和凋亡细胞的定量。数据以平均值＋ＳＤ表??示，ｎ?＝?６。＊＊与对照组相比，＊＊Ｐ＜０．０１，?＃＃与ＬＰＳ组相比，＃＃Ｐ＜０．０１。??１８??
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本文编号：2848560