虫草素及其转铁蛋白靶向脂质体的抗肿瘤活性研究

发布时间：2020-10-21 05:27

　　 背景/目的:癌症始终是威胁人类健康的第一大杀手。肝癌(liver cancer)是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤,临床上会采用手术切除、肝移植和放化疗等手段进行治疗,但晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低,中国每年死于肝癌人数约11万人,占全世界死亡人数的45%。乳腺癌是女性最常见的癌症之一,尽管科技医疗水平与日俱增,全球女性的患病风险仍居高不下。据统计,全世界每年死于乳腺癌的女性患者约有40万例。因此要做到癌症的早期发现、早期诊断和早期治疗。虫草素(cordycepin),别名虫草菌素、蛹虫草菌素等,是冬虫夏草中主要的活性成分,一种内源性核苷,具备了抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗菌、免疫调节、清除氧自由基等多种药理作用。虽然虫草素显示出良好的临床应用前景,但不难发现药物到达病灶后存在吸收率低,溶解度差,直接给药作用效果不佳等缺点,本研究的目的就在于开发有效的靶向脂质体载药系统以提高虫草素的溶解度和生物活性,并对该载药系统进行体内外的各项指标评价。本研究主要包括以下几个方面:1、虫草素抗肝癌和抗乳腺癌活性评价癌细胞凋亡一直以来受到人们广泛关注,有研究表明线粒体是凋亡的核心部位,可作为癌症治疗的有效靶点,当线粒体膜电位下降会进而启动Caspase依赖的细胞凋亡过程MAPKs及AKT信号通路通过调控m TOR蛋白活性而抑制肿瘤生长。通过以肝癌细胞Hep G2和PLC/PRF/5以及乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231为细胞模型,分别对其进行细胞活力,细胞增殖,LDH活性,活性氧水平,线粒体膜电位变化及凋亡相关蛋白含量分析等一系列体外实验测定,同时在裸鼠中进行体内实验,使用剂量为30mg/kg的虫草素进行为期两周的药物治疗。结果发现虫草素可以诱导肝癌细胞和乳腺癌细胞的凋亡,促进癌细胞内ROS的积累,导致线粒体相关凋亡蛋白含量发生变化,并且给药后裸鼠肿瘤体积明显降低。因此,体内外实验均证实了虫草素的抗癌效果,确定了虫草素的药用安全性。2、虫草素脂质体的制备及表征初步体内代谢脂质体是一种具有良好生物相容性的有效载体,常用于靶向输送药物,提高治疗效果,并降低敏感器官的毒副作用。通过体外分析虫草素脂质体中虫草素的HPLC方法,建立了虫草素的标准曲线,在0.1-200ug/ml的范围内线性良好,R2达到1,包封率为65.3%。方法学考察后发现其精密度、稳定性均较好。为了增加其实际应用价值,我们又建立了一个聚乙二醇脂质中间层和靶向配体外层的多层脂质纳米粒,主要通过转铁蛋白修饰的脂质体并且包载含有虫草素新型载药系统,并对虫草素、脂质体、转铁蛋白修饰的脂质体进行粒径和电位的检测。结果显示,转铁蛋白修饰的脂质体粒径为125nm,较脂质体91nm的粒径略大,转铁蛋白修饰的脂质体电位为2.9m V,比脂质体的9.2m V小,有显著性差异。又通过对脂质体、转铁蛋白脂质体进行了体外指标检测,均显示出脂质体和转铁蛋白脂质体都有较好的释放速度,转铁蛋白脂质体比脂质体的细胞毒性更强,摄取度高,诱导细胞凋亡能力更显著。3、虫草素脂质体及转铁蛋白脂质体抗肝癌和乳腺癌活性评价利用肝癌细胞系(Hep G2和PLC/PRF/5)和乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)分别探究了LPs和Tf-LPs两种不同给药系统的体内、体外抗肿瘤作用及其相关机制。采用细胞抑制试验、ROS水平测定、线粒体膜电位检测、western blot、细胞摄取途径等对LPs和Tf-LPs载药系统进行了抗肿瘤活性分析,并通过小鼠肝癌模型和乳腺癌模型进行体内抗肿瘤作用的考察。体外评价结果表明,肝癌细胞系(Hep G2和PLC/PRF/5)和乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)经Tf-LPs-虫草素组药物作用后其IC50值明显低于其他给药组,并且通过流式细胞术检测Tf-LPs-虫草素组的转染效率也明显优于LPs-虫草素组。抑制剂的加入是为了更好的对药物摄取途径进行探究,验证后发现它是以转铁蛋白介导的内吞途径进入肿瘤细胞并发挥作用。由于细胞内活性氧的积累会使线粒体膜电位发生改变,并引起细胞凋亡。Tf-LPs显著增加了细胞内ROS的产生并诱导线粒体膜电位去极化。western blot检测发现经Tf-LPs药物作用后促凋亡蛋白上升趋势显著,抗凋亡蛋白含量减少。这表明Tf-LPs-虫草素可以抑制两种肿瘤细胞系的细胞增殖,而且通过与ROS相关的线粒体途径诱导癌细胞的凋亡。体内评价结果表明,Hep G2和PLC/PRF/5肝癌异位模型和MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌异位模型经过14天药物治疗后,裸鼠体重变化不明显,而Tf-LPs-虫草素组肿瘤体积显著下降,说明Tf-LPs能运载更多的药物进去细胞发挥抗肿瘤作用。因此,在对脂质体的制备工艺和方法进行稳定性和安全性等考察后,又研究其在体内外的抗肿瘤活性,结果表明虫草素包被上转铁蛋白修饰的脂质体靶向制剂具有更好的抗肿瘤效果,为成为癌症靶向治疗的新型制剂提供理论依据。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：

虫草素（Cordycepin）又名虫草菌素、3'-脱氧腺苷，是冬虫夏草类天然药主要活性成分[1]。虫草素于 1950 年被首次发现，Cunningham 等观察到被蛹寄生的昆虫组织不易腐烂，继而从蛹虫草培养液中分离出一种具有抗菌活性质，命名为虫草素[2]。虫草素是从真菌中分离出的第一个核苷类抗生素[3]，外学者都对其表现出浓厚的兴趣。半个世纪以来，研究者们对虫草素的菌株、分离提取、合成修饰、药理活性、作用机制和产品研发等进行了系统深入究[4, 5]。1997年虫草素作为18种抗癌新药之一被美国NCI引入进行开发研究00 年美国 NCI 研发人员及国家癌症研究所波士顿医学中心（BMC）的教授同证实了虫草素对白血病具有很好的药物疗效，便开始与 OXIGEN 公司寻作，经美国 FDA 批准，以虫草素为主要成分的核苷类新药已进入三期临床[6虫草素的药理学活性尤其是抗肿瘤机制的研究成为极其活跃的研究领域之多研究证实了虫草素具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、免疫调节和清除自由基种药理活性[7]，见图 1.1。

图 1.2 虫草素分子结构式Fig 1.2 Molecular formula of cordycepin进展水平的提高，生活节奏的加快，人类生活方受到广泛关注。肿瘤正在成为危及人类生命种疾病中第二位，仅次于心脑血管疾病。卫，我国癌症年新发病例约为 200 万，因癌症症治疗方法主要有手术治疗、放疗和化疗等疗，局限性较大，尤其是对于癌细胞已经扩一种全身性治疗手段，对于原发病灶和转移然抗肿瘤药物，以其副作用小、疗效确切等

第一章 绪论物合成[3, 34]。虫草素结构与腺苷非常相似，可参与各种细胞中分子过程，例如DNA 或 RNA 的合成。它可以与腺苷 A3 受体结合从而提高 GSK-3β，降低细胞周期蛋白 D1 发挥细胞毒性。在 RNA 合成的转录过程中，一些酶不能区分腺苷和虫草素，导致了 3’-脱氧腺苷（虫草素）的引入，替代正常核苷，阻止了含氮碱基（A，U，G 和 C）的进一步掺入，导致转录过程的提早终止[10, 11, 35]。Wong等[11]报道了虫草素可以缩短 mRNA 的 polyA 尾，降低附着力并抑制细胞之间的附着。相关研究表明虫草素可以通过激活丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs）关闭 mTOR 信号通路，抑制细胞翻译、增殖和生长，具体机制尚未明确[36]。
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 Chang-Jiang Lei;Jia-Ni Liu;Rong Wu;Zhi-Xiong Long;Jiang-Zhou Zhang;Dan Tao;Yan-Ping Liu;;Change of the peripheral blood immune pattern and its correlation with prognosis in patients with liver cancer treated by sorafenib[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2016年06期

2 姜冀;宋央央;舒琦瑾;;中药在肿瘤细胞凋亡途径方面的研究进展[J];黑龙江中医药;2014年02期

3 郑素玲;王艳华;吴朝晖;;山药对老龄小鼠免疫器官组织结构的影响[J];中国老年学杂志;2007年19期

相关博士学位论文 前1条

1 李文杰;莪术醇肝靶向脂质体的制备及其抗肿瘤研究[D];广州中医药大学;2014年

本文编号：2849702