基于UPLC-QTof-MS的宽皮柑橘和橙果皮化学成分及代谢组学研究

发布时间：2020-10-21 10:51

　　 柑橘(Citrus)是世界种植范围最广的果树,种质资源丰富,主要有宽皮柑橘(Citrus reticulata)、甜橙(Citrus sinensis)、柠檬(Citrus limon)、柚类(Citrus grandis)、葡萄柚(Citrus paradisi)、枸橼(Citrus medica)等。柑橘果实集药食两用于一身,含多种生物活性成分,包含酚酸、类黄酮、类胡萝卜素和类柠檬苦素等,具有抗氧化、缓解肥胖、预防和治疗癌症等功效。研究表明,柑橘果皮中化学成分的种类和含量普遍高于果肉,因此,分析研究柑橘果皮的化学成分对于开发其药用价值具有重要意义。本文主要基于超高效液相色谱联用四级杆飞行时间质谱技术(UPLC-QTof-MS)和Progenesis QI代谢组学软件对宽皮柑橘(Citrus reticulata)和甜橙(Citrus sinensis)的果皮进行了多甲氧基类黄酮(Polymethoxylated flavonoids,PMFs)测定、非靶向代谢轮廓分析、体外抗氧化活性评价、代谢组学四方面的研究,主要内容如下:1基于UPLC-QTof-MS简单快速测定宽皮柑橘和甜橙果皮中的PMFs PMFs是指在黄酮母核上含4个及以上甲氧基的一类天然产物,是柑橘属果实含有的一类特殊的类黄酮,比普通的类黄酮具有更强的抗癌效果。本节利用超高效液相色谱联用高分辨质谱建立了一种简单、快速、灵敏的方法对宽皮柑橘和橙果皮的甲醇提取物中的PMFs进行了定性与定量分析。方法学验证显示该方法稳定可靠,适合用于柑橘中PMFs的分析。主要结果如下:(1)通过MS~E技术,分析PMFs的二级质谱碎片,与标准对照品和文献中谱图比较后,在14种柑橘果实中共鉴定出42种PMFs,其中33种为多甲氧基黄酮,9种为多甲氧基黄烷酮。(2)同时对其中的13种多甲氧基黄酮进行了含量测定。其中Nobiletin,Sinensetin,Tangerin和3,5,6,7,8,3,4’-Heptamethoxyflavone含量较高,宽皮柑橘中PMFs的种类和含量普遍较橙类中高。(3)检测限和定量限分别为75pg/mL和0.25 ng/mL,线性范围0.500-1000ng/mL,相关系数均在0.995以上。回收率范围94.52%-105.57%,日间和日内重复性相对标准偏差分别小于2.79%和5.43%。2宽皮柑橘和橙果皮的化学成分和体外抗氧化活性研究柑橘中含多种活性成分,主要有类黄酮、酚酸、类柠檬苦素、类胡萝卜素等。本节主要基于UPLC-QTof-MS对10种宽皮柑橘和6种橙类果皮的甲醇提取物进行了系统的分析鉴定,归纳总结了黄酮类化合物的质谱裂解行为,并用ABTS法、DPPH法和FRAP法评价了这16种柑橘的体外抗氧化活性,将活性与化学成分进行关联分析。主要结果如下:(1)在16种柑橘果皮中共检出92种化学成分,包括4种黄酮苷元、22种多甲氧基黄酮、10种多甲氧基黄烷酮/查尔酮、33种黄酮苷,9种酰基化黄酮苷和8种类柠檬苦素、3种香豆素苷类以及3种其它类型的化合物。化合物的种类分布大致是野生宽皮柑橘多于栽培宽皮柑橘多于橙类。莽山橘和细皮狗屎柑所含化合物种类较多,分别为84和82种,S26锦橙和长叶橙最少为46种。(2)抗氧化活性综合指数(Antioxidant Potency Composite,APC)综合三种方法评价柑橘总的体外抗氧化能力,岑溪酸橘果皮的抗氧化能力最强,莽山橘排第二,二者均属于野生宽皮柑橘。最弱的为先锋橙,其次是S26锦橙,二者均属橙类。总体来看宽皮柑橘较橙类的抗氧化能力强,野生宽皮柑橘较栽培宽皮柑橘抗氧化能力强。(3)关联分析结果表明,正离子模式下共有8种化合物与抗氧化能力呈极显著相关。其中主要影响ABTS法抗氧化能力的化合物是Natsudaidain-3-O-HMG-glucoside,与DPPH法抗氧化能力呈极显著正相关的化合物为Caffeicacyl-hydroxyl-methoxylflavanone-O-diglycoside,与FRAP法抗氧化能力呈极显著正相关的化合物有7个,依次为Caffeicacyl-hydroxyl-methoxylflavanone-O-diglycoside;Dihydroxy-flavone-dimethoxyflavone-O-glucoside;5,7,4’-Trimethoxyflavone;(2R)-Hesperidin;Swertisin-5-O-β-D-glucoside;5,7,3’,4’-Tetramethoxyflavone-6-O-β-D-glucoside;1-Feruloyl-β-D-glucopyranoside。负离子模式下,共有9个化合物与抗氧化能力呈极显著正相关。其中与ABTS法呈极显著正相关的化合物有Natsudaidain-3-O-(HMG)-glucoside和Isopyrenin,影响FRAP法抗氧化能力的化合物有7个,分别为Caffeicacyl-hydroxyl-methoxylflavanone-O-diglycoside;5,7,3’,4’-Tetramethoxy-flavone-6-O-β-D-glucoside;Dihydroxyflavone-dimethoxyflavone-O-glucoside;Tricin-5-glucoside/Tricin-7-glucoside;(2R)-Hesperidin;Swertisin-5-O-β-D-glucoside;Hesperetin-7-O-glucoside。3宽皮柑橘和橙果皮提取物的代谢组学鉴别分析代谢组学是研究生物体系(细胞、组织或生物体)受外部刺激后所产生的所有代谢产物变化的一种研究方法。本节利用UPLC-QTof-MS结合Progenesis QI对宽皮柑橘和橙两类柑橘果皮进行非靶向代谢组学分析,寻找不同种类柑橘的代谢差异物。主要结果如下:(1)使用UPLC-QTof-MS平台采集10种宽皮柑橘和6种橙类果皮代谢轮廓图谱,质量控制(Quality Control,QC)样品用于评价系统的稳定性。正离子模式下RSD≦30%的峰个数占整个数据的91.34%,负离子模式下RSD≦30%的峰个数占整个数据的88.79%,主成分分析(PCA)中QC样本聚集程度良好,证明数据采集方法可靠,系统稳定。(2)在多元统计分析中,使用主成分分析(PCA)这种无监督的模式识别观察所有样本的分散与聚集程度。正离子模式下,R~2X[1]=0.5051,R~2X[1]=0.1519,第一主成分和第二主成分共解释原变量的65%,且宽皮柑橘和橙类在第一主成分上即可得到分离,无离异样本。在正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)中,两组样品在第一主成分得到完全分离,R~2Y=99%,Q~2=90%,证明模型具有良好的解释性和预测性,所得数据可靠。通过重要变量投影(VIP)和S-Plot图可筛选潜在生物标志物,5条标准为:OPLS-DA模型中变量重要性投影指标(VIP)1,|p|0.1,倍数变化(Fold Change,FC)2,Anova(p)0.05和相关系数|p(corr)|0.5作为筛选条件,得可用于鉴别宽皮柑橘和橙类的潜在标志物有5个。同理可得负离子模式可用于鉴别宽皮柑橘和橙类的潜在标志物有6个。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284.1
【部分图文】：

21图 2-1 宽皮柑橘和橙类的基峰离子流图（BPI）（A）蕉柑（C. reticulata）正离子模式下的基峰离子流图；（B）8045 甜橙（C. sinensis）正离子模式下的基峰离子流图；（C）13 种标准对照品的基峰离子流图

图 2-2 化合物 27 的 MSE扫描谱图（A）低能量碰撞通道；（B）高能量碰撞通道对于多甲氧基黄烷酮来说，优先发生 C 环的 Retro-Diels-Alder (RDA)重排反应：常从 C 环的 1, 3 或 1, 4 断裂产生1,3or4A+and1,3or4B+离子，因此这些离子常常作为多甲氧基黄烷酮的基峰离子。其次，1,3A+或1,3B+还会发生 15 Da (CH3)、28Da (CO)、30 Da (2CH3) 和 33 Da (CH3+H2O)等中性丢失产生相应的特征离子。判断 3 位是否取代的关键离子为0or1, 2A+和0or1, 2B+。对于查尔酮来说，基峰离子xB+和yA+及在基峰离子上中性丢失 15Da(CH3)、28 Da (CO)和 30 Da (2CH3)产生的响应离子都是查尔酮的诊断离子。值得注意的是，查尔酮较易将电荷保留在 B 环，紫外最大吸收波长在 330-370nm 范围，而黄烷酮更倾向于将电荷保存在 A 环，最大吸收波长在 320nm。以化合物 11 为例描述多甲氧基黄烷酮的鉴定过程：首先，从低能量通道（图 2-3A）得化合物的准分子离子峰 m/z375.1436，计算得分子式为C20H22O7，对比图 2-1 可知该化合物为一个五甲氧基黄烷酮或五甲氧基查尔酮。高能量通道的二级碎片谱图（图 2-3B）中，基峰离子 m/z211.0601(1,3A+)和丰度次高占 26.42%的离子 m/z 196.0366 (1,3A+-CH3)则被认为是多甲氧基黄烷酮的诊断离子，因此该化合物是一个五甲氧基黄烷酮。从低质量区的 m/z 211.0601(1,3A+) 和 m/z

图 2-3 化合物 11 的 MSE扫描谱图（A）低能量碰撞通道；（B）高能量碰撞通道表 2-3 14 种柑橘中 42 种多甲氧基类黄酮分类表Peaks Amount Formula MW Classno. of -OHno. of–CH31 1 C17H14O6314 Dihydroxydimethoxyflavone 2 213 1 C19H20O7360 Monohydroxytetramethoxyflavanone 1 42,5,8,10,30,41 6 C19H18O7358 Monohydroxytetramethoxyflavone 1 43,4,7,15,36,38 6 C18H16O6328 Monohydroxytrimethoxyflavone 1 318,31 2 C20H22O8390 Monohydroxypentamethoxyflavanone 1 59,12,16,34 4 C20H20O8388 Monohydroxypentamethoxyflavone 1 511,23,37,42 4 C20H22O7374 Pentamethoxyflavanone 0 514,21,33 3 C20H20O7372 Pentamethoxyflavone 0 526,39 2 C21H24O8404 Hexamethoxyflavanone 0 66,17,32,40 4 C21H22O9418 Monohydroxyhexamethoxyflavone 1 619,22,28 3 C19H18O6342 Tetramethoxyflavone 0 420,25,27,35 4 C21H22O8402 Hexamethoxyflavone 0 629 1 C22H24O9432 Heptamethoxyflavone 0 725 1 C18H16O5312 Trimethoxyflavone 0 3基于以上鉴定规律，我们在 7 种宽皮柑橘和 7 种橙类中共鉴定出 42 种多甲氧基类黄酮。其中 35 种是通过与文献中比对确定的结构，化合物 1,4,6,8,9,10,13 和化合物 37 首次在柑橘属中发现（图 2-5）。在 14 种柑橘中，宽皮柑橘多甲氧基黄
【参考文献】

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1 许茹;钟凤林;吴德峰;;中药青皮本草考证[J];中药材;2013年06期

本文编号：2850030