大吴风草提取物的抗帕金森作用及机制研究

发布时间：2020-10-22 02:15

　　 近年来,神经退行性疾病发病率逐年升高,帕金森症(Parkinson's disease,PD)是其中的典型代表之一,多发于六十岁以上人群,年龄是PD发病的主要诱因之一,随着人口老龄化的发展,PD的发病率预计会急剧增加。PD是一种慢性的进行性运动障碍,目前仍没有较为有效的治疗手段或较显著的阻止PD病情发展的方法。PD的发病机制较为复杂,研究发现,氧化应激是引起黑质致密部胺能神经元退化或病变的主要因素之一,与PD的发病有密切联系。Farfugium japonicumi(FJ)是一种分布于东亚沿海地区的菊科植物,民间称其为大吴风草,在传统中药中常被用于解热镇痛抗炎。此外,在近些年的药理学研究当中,大吴风草及其全提取物在抗肿瘤及抗炎方面的活性及机制也被研究及证实。在前期研究当中发现,FJ全提取物对LPS诱导的Raw264.7细胞内NO水平的升高具有显著的抑制作用,同时以粗提物分离纯化后所得纯品3β-angeloyloxy-8β,10β-dihydroxyeremophila-7(11)-en-12,8α-lactone(FJ1)为研究对象,发现FJ1能减少LPS引起的细胞内iNOS及nNOS的活化以及细胞内ROS及NO水平的上升,这些都与PD发病机制有密切联系,据此推测FJ的提取物可能具有神经保护作用,本课题的目的是对FJ提取物神经保护作用进行筛选,并选取最优提取物,对FJ神经保护作用的作用机制进行探讨,从而在体外评估FJ提取物用于PD预防治疗的可能性。在筛选过程中,采用Griess Reagent法检测FJ提取物对LPS诱导的NO生成的抑制作用,筛选出六种具有抑制NO生成作用的提取物。检测百草枯(Paraquat,PQ)对PC12细胞及SH-SY5Y细胞的细胞毒性,用PQ诱导PC12细胞及SH-SY5Y细胞构建神经损伤模型,用MTT法初步检测这六种提取物对PQ诱导的神经损伤的保护作用,发现六种化合物对PQ诱导的神经损伤均具有不同程度的保护作用,其中FJ1的保护作用最为显著。进一步的实验当中,我们以FJ1为研究对象,检测其神经保护作用的机制。通过Annexin V-FITC/PI双染法及DAPI荧光染色观察发现,FJ1能通过减少PQ诱导的细胞凋亡来减弱PQ引起的神经损伤。通过JC-1染色法检测FJ1预处理后细胞内线粒体膜电势变化情况,并通过Western Blot法检测细胞中相关凋亡蛋白的表达量,结果显示FJ1预处理能有效抑制PQ引起的caspase-9、caspase-3的活化、Bax/Bcl-2比例的升高以及细胞色素C的释放,并减弱PQ引起的线粒体膜电势的降低,这些结果都表明FJ1预处理能抑制线粒体凋亡途径的活化。此外通过DCFH-DA探针检测FJ1预处理对细胞内ROS水平的变化,并通过SOD、GSH及MDA试剂盒检测细胞内SOD、GSH活力以及细胞脂质过氧化水平,结果显示FJ1预处理能维持细胞内SOD及GSH活力,并降低细胞内ROS及MDA水平,这表示FJ1对神经细胞保护作用的潜在机制可能与降低PQ引起的氧化应激有关。综上所述,FJ1能通过提高细胞抗氧化防御的能力,降低PQ引起的细胞内氧化应激水平的升高,进而抑制PQ引起的线粒体凋亡途径的激活,最终对PQ诱导的SH-SY5Y细胞损伤产生保护作用。本实验检测了FJ系列化合物对PQ诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用,并探究了其抗氧化作用机制,为PD的预防及治疗提供了新的依据。同时,本实验采用PQ这一应用范围广的农药作为损伤因素,对环境学及流行病学研究都具有一定的意义。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
缩略语词汇表
第一章 绪论
    1.1 帕金森症
    1.2 氧化应激
    1.3 氧化应激与PD
        1.3.1 多巴胺的新陈代谢
        1.3.2 线粒体功能障碍
        1.3.3 OS诱发细胞凋亡
        1.3.4 OS诱发神经兴奋性中毒
    1.4 PQ与PD
    1.5 帕金森模型
    1.6 前期研究
第二章 FJ系列化合物抗帕金森作用的研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 化合物
        2.1.3 试剂
        2.1.4 主要试剂配制
        2.1.5 仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞的复苏、培养及冻存
        2.2.2 MTT法检测PQ、FJ系列化合物细胞毒性
        2.2.3 MTT法检测FJ系列化合物对PQ诱导的SH-SY5Y细胞神经损伤的保护作用
        2.2.4 Griess Reagent法检测NO生成
    2.3 实验结果
        2.3.1 FJ系列化合物预处理对NO的抑制作用
        2.3.2 FJ系列化合物对PC12、SH-SY5Y细胞存活率影响
        2.3.3 PQ对PC12、SH-SY5Y细胞存活率影响
        2.3.4 FJ系列化合物预处理对PQ诱导PC12、SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
    2.4 讨论
第三章 FJ1抗帕金森作用的抗氧化机制研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞株
        3.1.2 化合物
        3.1.3 试剂
        3.1.4 主要试剂配置
        3.1.5 仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞的复苏、培养及冻存
        3.2.2 MTT法检测FJ1对PQ诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
        3.2.3 细胞凋亡检测
        3.2.4 细胞活性氧水平（ROS）检测
        3.2.5 细胞内线粒体膜电势（MMP）的检测
        3.2.6 细胞内GSH水平检测
        3.2.7 细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性检测
        3.2.8 细胞脂质过氧化物检测
        3.2.9 相关蛋白表达（Western Blot）
    3.3 实验结果
        3.3.1 PQ对SH-SY5Y细胞的损伤及FJ1的保护作用
        3.3.2 FJ1抑制PQ诱导的细胞凋亡
        3.3.3 FJ1阻止PQ诱导细胞线粒体膜电势的降低,并减少cytochrome c的释放
        3.3.4 FJ1调节Bax和Bcl-2的表达,并抑制Caspase-9及Caspase-3的活化
        3.3.5 FJ1减弱PQ诱导的细胞内ROS聚集,并减少MDA的生成
        3.3.6 FJ1增强细胞内抗氧化防御系统
    3.4 总结及讨论
参考文献
致谢
攻读学位期间成果
学位论文评阅及答辩情况表

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本文编号：2850947