目的:1.筛选去卵巢大鼠股骨远端骨组织中差异表达的mRNA和lncRNA并进行功能性分析和生物信息学分析,探讨其在绝经后骨质疏松症中潜在作用;2.研究差异表达的mRNA富集的通路在去卵巢大鼠中的变化及骨疏康的调控作用;3.研究差异表达的lncRNA的靶基因及相关通路在去卵巢大鼠中的变化及骨疏康的调控作用。方法:1.去卵巢大鼠股骨mRNA和lncRNA表达谱研究24只6月龄SD大鼠随机分为假手术组(sham,12只)和模型组(OVX,12只)。通过去卵巢法建立绝经后骨质疏松症大鼠模型,以假手术大鼠作为对照,取两组大鼠的股骨远端骨组织进行高通量测序,建立股骨远端骨组织中mRNA和lncRNA的表达谱并进行差异性分析,然后采用Real-time PCR对差异表达的结果进行扩大样本量验证,验证测序结果的可靠性,最后对差异表达的mRNA和lncRNA进行功能性分析和生物信息学分析,以探讨这些差异表达的mRNA和lncRNA在绝经后骨质疏松症中潜在作用。2.骨疏康抑制去卵巢大鼠骨细胞凋亡,激活BMP-2/Smads信号通路(1)骨疏康对去卵巢大鼠的骨保护作用48只6月龄SD大鼠随机分为4组,每组12只:假手术组(sham组),模型组(OVX组),骨疏康组(GSK组),阿仑膦酸钠组(ALN组)。建立去卵巢大鼠骨质疏松模型,12周后进行药物干预,给药剂量按照人与大鼠体表面积折算,GSK组给药剂量为0.27g/kg,ALN组给药剂量为1.02mg/kg,sham组和OVX组分别给予等体积生理盐水灌胃。药物干预12周后取材,进行各项指标的检测:①麻醉后检测大鼠全身骨密度和腰椎骨密度,②检测离体股骨骨密度,③股骨远端microCT扫描,④股骨远端HE染色。(2)骨疏康对去卵巢大鼠BMP2/Smads信号通路的影响取上述实验中大鼠,麻醉生效后,大鼠取仰卧位,大腿内侧入路去除肌肉组织,迅速分离双侧股骨,①左侧股骨采用10%中性多聚甲醛固定24小时,进行ALP染色、Trap染色,②右侧股骨采用液氮冻存,提取总RNA进行qRT-PCR检测相关基因的表达,提取总蛋白和磷酸化的蛋白,采用western blot检测相关蛋白的表达。(3)去卵巢大鼠骨组织中骨细胞凋亡情况及骨疏康的干预作用取上述实验中大鼠左侧股骨,进行TUNEL染色;取右侧股骨提取总RNA进行qRT-PCR检测相关基因的表达,提取总蛋白进行western blot检测相关蛋白的表达。结果:1.去卵巢大鼠股骨mRNA和lncRNA表达谱研究(1)去卵巢大鼠动物模型的建立两组大鼠造模12周后进行骨密度检测,与sham组相比,OVX组大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。对离体股骨的骨密度检测和microCT扫描发现,与sham组相比,OVX组离体股骨的整体骨密度和股骨头、股骨近端、股骨干、股骨远端骨密度水平均显著降低(P0.05)。对于microCT检测结果,与sham组相比,OVX组中BV/TV,BS/TV和Tb.N的水平显著降低,而Tb.Sp水平明显增加(P0.05),两组间Tb.Th比较虽然无统计学差异,但OVX组Tb.Th水平有下降趋势。HE染色结果显示,与sham组相比,OVX组骨小梁变薄,骨小梁数量明显减少,排列稀疏,骨小梁间隙相对较宽,这与microCT的三维图像相一致。这些结果表明,与sham组相比,OVX大鼠股骨的骨量明显减少,股骨远端的骨微结构明显变差。(2)转录本的差异表达分析对两组骨组织样本进行高通量测序和转录本的差异表达分析,发现440条mRNA存在组间差异表达,其中160条上调和280条下调,17条lncRNA存在组间差异表达,其中9条上调和8条下调,21条TUCP存在组间差异,其中11条上调和10条下调。对差异表达的mRNA进行生物信息学分析发现所富集到的信号通路主要包括破骨细胞分化,抗原处理和呈现,Hippo信号通路,雌激素信号通路,吞噬,RNA转运,核糖体,泛素介导的蛋白水解,mTOR信号通路等,对lncRNA和TUCP进行靶基因预测,发现多个差异表达的转录本预测到BMP家族,对所有靶基因进行KEGG富集分析发现,lncRNA和TUCP对核糖体途径,胞吞作用,粘蛋白型O-聚糖生物合成,长期抑郁,FcγR介导的吞噬作用,甲状腺激素信号通路,血管平滑肌收缩,神经活性配体-受体相互作用,细胞溶质DNA传感途径,RIG-I样受体信号通路,TRP通道的炎症介质调节等信号通路均有调节作用。2.骨疏康抑制去卵巢大鼠骨细胞凋亡,激活BMP-2/Smads信号通路实验过程中,因各种意外死亡6只大鼠,最终纳入研究的实验动物数量为42只。(1)骨疏康对去卵巢大鼠的骨保护作用①对各组大鼠进行骨密度测定,发现与sham组相比,OVX组大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明显减低(P0.05);与OVX组相比,GSK组和ALN组大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明显升高(P0.05)。②对离体股骨的骨密度检测发现,OVX组股骨头,股骨近端,股骨干,股骨远端和股骨整体的骨密度水平均显著低于sham组(P0.05)。在GSK组和ALN组中,股骨头股骨,股骨近端,股骨干,股骨远端和股骨整体的骨密度水平均显著高于OVX组(P0.05)。其中,GSK组股骨远端的骨密度水平高于ALN组,尽管没有统计学差异。③对股骨远端进行microCT扫描,发现与sham组相比,OVX组BV/TV,BS/TV,Tb.Th和Tb.N的水平显著降低,而Tb.Sp水平增加(P0.05)。GSK和ALN组中Tb.Sp水平显著降低,而其他参数水平则增加(P0.05)。而且,GSK和ALN组之间没有统计学差异。这些数据表明GSK和ALN都能够增加骨小梁体积。④对股骨远端进行HE染色,发现OVX组骨小梁变薄,断裂,骨小梁数量减少,骨小梁间隙增宽,而GSK组和ALN组骨小梁相对较厚实,连接较多,骨小梁间隙变窄。对比microCT的三维重建图发现,股骨骨小梁结构的变化与HE染色显示的组织学变化一致。(2)骨疏康对去卵巢大鼠BMP2/Smads信号通路的影响①ALP染色和Trap染色发现,OVX组骨小梁上ALP阳性成骨细胞数量减少,染色较浅,呈灰色甚至灰白色,TRAP阳性破骨细胞数量增加,酒红色染色明显甚至融合成片,主要位于骨小梁边缘。与OVX组相比,GSK组ALP阳性成骨细胞染色变深,破骨细胞数量变少,染色呈浅红色。②进行qRT-PCR检测分析发现,与sham组相比,OVX组中BMP-2,Osterix和Runx2的mRNA表达显著下调(P0.05)。而Smadl和Smad5基因没有明显变化。有趣的是,GSK治疗可引起BMP-2,Osterix和Runx2 mRNA水平的明显上调,而ALN组只有Runx2mRNA 水平上调(P0.05)。③进行western blot检测分析发现,与sham组相比,OVX组的BMP-2,Smadl,p-Smadl,p-Smad5和Runx2的蛋白质表达水平下调(P0.05),Smad5和Osterix有下降趋势,但无统计学差异,这说明在去卵巢大鼠模型中,BMP-2/Smads信号通路受到抑制。与 0VX 组相比,GSK 组 BMP-2,p-Smadl,p-Smad5,Osterix 和 Runx2 的蛋白表达水平均升高(P0.05)。ALN组BMP-2,p-Smadl,Osterix和Runx2的表达水平升高(P0.05)。(3)去卵巢大鼠骨组织中骨细胞凋亡情况及骨疏康的干预作用①TUNEL染色和凋亡率的测定提示,OVX组具有更多的TUNEL阳性骨细胞,与OVX组相比,GSK组TUNEL阳性骨细胞显著减少(P0.05)②通过qRT-PCR检测基因表达水平发现,与sham组相比,OVX组Bcl-xL基因的表达水平降低(P0.05),Bak水平升高(P0.05),Bcl-2表达水平有所降低,但缺乏统计学意义。与OVX组相比,GSK组Bcl-xL的基因水平显著增加,Bak水平显著降低(PO.05)。③通过Western blot检测蛋白水平发现,与sham组相比,0VX组各蛋白水平与基因水平的检测结果相符合。与OVX组相比,GSK组Bcl-xL蛋白水平升高,Bak蛋白水平降低(P0.05)。结论:1.去卵巢大鼠骨组织中存在440条差异表达的mRNA(160条上调和280条下调),其主要富集的通路与凋亡密切相关。2.去卵巢大鼠骨组织中存在差异表达的17条lncRNA(9条上调和8条下调)和21条TUCP(11条上调和10条下调),对差异表达的lncRNA和TUCP的进行靶基因预测发现多个差异表达的转录本预测到BMP家族。3.骨疏康可通过刺激BMP-2/Smads信号途径的活化,降低骨细胞的凋亡率来改善去卵巢大鼠股骨的骨密度和骨微结构特性。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
采用ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ?ｖｌ．?３．?１进行新转录本的预测。ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ应用网络流算法以及可??选的从头组装来组装和定量代表每个基因座的多个剪接变体的全长转录物。设置不同??的筛选条件，筛选最终得到的ｌｎｃＲＮＡ进行后续分析，筛选流程如图１所示：??＾???０４——ＫＢ??图１筛选流程图??在进行筛选之前，首先使用Ｃｕｆｆ＇ｍｅｒｇｅ软件对各样品拼接得到的转录本进行合并，并??去掉其中链方向不确定的转录本，得到本次测序完整的转录组信息。之后，对合并的??转录本集合按照图１进行ｌｎｃＲＮＡ的筛选，其中对于ｓｔｅｐ５，取没有编码潜能的转录本??的交集作为本次分析预测得到的ＩｎｃＲＮＡ数据集，取至少被一种编码潜能预测软件认??为有编码潜能的转录本作为本次分析的ＴＵＣＰ?（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ?ｏｆ?ｕｎｃｅｒｔａｉｎ?ｃｏｄｉｎｇ??ｐｏｔｅｎｔｉａｌ），这些转录本中可能包含一部分具有一定编码潜能的ＩｎｃＲＮＡ，因此我们将??它们作为单独的一类转录本纳入到后续的分析［｜７１］。本次分析采用ＣＮＣＩ??（Ｃｏｄｉｎｇ－Ｎｏｎ－Ｃｏｄｉｎｇ－Ｉｎｄｅｘ）?（ｖ２）分析工具［１＜」、ＣＰＣ?（Ｃｏｄｉｎｇ?Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ?Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）??（０．９－ｒ２）分析工具［１７３］和?Ｐｆａｍ?Ｓｃａｎ?（ｖｌ．?３）?Ｕ７４’１７Ｓ］分析工具。??（４）
统计学差异，但０ＶＸ组Ｔｂ．Ｓｐ水平有增高趋势、Ｔｂ．Ｔｈ水平有下降趋势（表１０）。ＨＥ??染色结果显示，与ｓｈａｍ组相比，０ＶＸ组骨小梁变薄，骨小梁数量明显减少，排列稀疏，??骨小梁间隙相对较宽，这与ｍｉｃｒｏＣＴ的三维图像相一致（图２）。这些结果表明，与??ｓｈａｍ组相比，０ＶＸ大鼠股骨的骨量明显减少，股骨远端的骨微结构明显变差。??表９去卵巢大鼠离体股骨骨密度＿（ｇ／ｃｍ２）??组别ｎ?股骨全段?股骨头?股骨近端?股骨干?股骨远端??ｓｈａｍ?组?１２?０．３３６２±０．?００７０?〇．２７８９±０．?００９７?〇．３８１１±０．?０２２４５?〇．３４５４±０．?０２９１?０？?３３５７±０．?０１２９??０ＶＸ?组?１２?０．２８３０±０．?０２２４＊?〇．２４７９±０．?０１８６＊?〇．３０７７±０．?０３０９＊?〇．２７８４±０．?０１９９＊?０■?２９５９±０．?０４０８＊??Ｚ?（ｔ）?－３．３１７?３．７８０?５．?１０１?５．６４８?－２．０１０??Ｐ?０．００１?０．００２?〇．〇〇〇?０．?〇〇〇?０．０４４??注：＇?与ｓｈａｍ组相比，／＞＜０．?０５。??表１０去卵巢大鼠股骨远端骨微结构??￣ｍ＼＼?ｎ?ＢＶ／ＴＶ?（％）?ＢＳ／ＴＶ?（１／ｉｎｍ）?Ｔｂ．Ｔｈ?（ｍｍ）￣Ｔｂ．?Ｎ?（１／ｍｍ）?Ｔｂ．Ｓｐ?（ｍｍ）??２３??
㈡高通量测序数据分析??Ｉ．骨组织总ＲＮＡ质量检测??１０个骨组织的总ＲＮＡ样本采用１％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，结果如图３Ａ所??示，各样本的电泳条带明亮、边缘清晰，均可明显看到２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ共３个条带，??除５Ｆ、６Ｆ、８Ｆ样本外，其他样本均可见到２８Ｓ条带亮度明显强于１８Ｓ条带。对５Ｆ、??６Ｆ、８Ｆ号骨组织重新进行总ＲＮＡ抽提，进行完整性检测，如图３Ｂ示２８Ｓ条带亮度明??显强于１８Ｓ条带，初步说明抽提的总ＲＮＡ样本完整性较高，无明显降解。??２４??
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