蓝萼甲素对人膀胱癌细胞的抗肿瘤作用及机制研究

发布时间：2020-10-23 05:55

　　 目的本研究旨在探讨蓝萼甲素在人膀胱癌细胞的抗肿瘤作用及具体机制,从而为开发靶向PI3K/Akt通路治疗膀胱癌的药物提供新思路。方法1.研究蓝萼甲素对人膀胱癌细胞增殖的抑制作用1.1通过CCK-8法检测蓝萼甲素对人膀胱癌细胞体外增殖的影响;1.2平板克隆实验检测蓝萼甲素对UMUC3细胞集落形成能力的影响;2.蓝萼甲素对膀胱癌细胞UMUC3抗肿瘤作用的机制探讨2.1用流式细胞术(FCM)检测经蓝萼甲素处理后UMUC3细胞周期的变化;2.2用AnnexinV/PI双染法检测蓝萼甲素诱导UMUC3细胞凋亡的发生;2.3 Western Blot方法分析周期、凋亡及PI3K/Akt通路相关蛋白的变化,从而验证蓝萼甲素是否通过PI3K/Akt通路诱导UMUC3细胞凋亡和G2/M周期阻滞;2.4用细胞免疫荧光进一步证实蓝萼甲素作用于UMUC3细胞后PI3K/Akt通路中p-Akt和Cleaved Caspase-3的细胞定位及表达量变化;3.蓝萼甲素对小鼠模型UMUC3移植瘤的影响及机制研究3.1皮下成瘤实验验证在体内水平下UMUC3细胞的成瘤能力以及蓝萼甲素对NOD/SCID小鼠模型UMUC3肿瘤的影响;3.2用免疫组化实验检测蓝萼甲素对皮下瘤组织中细胞增殖活性指标Ki-67和微血管密度指标CD31的影响。结果1.蓝萼甲素抑制人膀胱癌细胞的增殖和克隆形成1.1 10μM蓝萼甲素对人膀胱癌细胞UMUC3、HT1197、T24和J82的增殖有明显的抑制作用,但对人膀胱永生化细胞SV-HUC-1细胞的增殖没有明显抑制作用。不同浓度蓝萼甲素(0、2.5、5、10或40 μM)呈时间和剂量依赖性的抑制UMUC3细胞的活力,处理24、48、72和96小时后IC50值分别为18.87、9.77、6.75、5.40 μM。1.2与对照组相比,蓝萼甲素对UMUC3细胞集落形成的数量和大小呈现浓度依赖的明显抑制作用。2.蓝萼甲素可以使UMUC3细胞生长阻滞在G2/M期2.1细胞流式结果分析,随着蓝萼甲素浓度的升高,更多的细胞停滞在G2/M期,更少的细胞停滞在G0/G1期,而S期变化则没有统计学差异,这表明蓝萼甲素可引起UMUC3细胞阻滞在G2/M期。2.2免疫印迹法提示蓝萼甲素可引起p21WAF1/CIP1蛋白表达水平上调,但同时下调了 CyclinB1、CDK1和Cdc25C蛋白表达水平。3.蓝萼甲素诱导UMUC3细胞线粒体途径介导的凋亡3.1不同浓度蓝萼甲素处理UMUC3细胞24小时后细胞凋亡率分别为(10.16 ±1.10)%、(29.99 ±8.55)%和(53.61 ±5.11)%,但对照组的的细胞凋亡率仅为(4.37±1.17)%。3.2免疫印迹法分析表明,与对照组相比,蓝萼甲素实验组细胞的Bax蛋白表达水平增加,但Bcl-2蛋白表达水平降低,导致Bax/Bcl-2比值随着蓝萼甲素浓度升高而上调。此外,蓝萼甲素作用于UMUC3细胞后Caspase-9、Caspase-3、PARP蛋白表达水平下降,与之相应的是有明显的Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP 蛋白的累积变化。3.3免疫荧光染色显示,蓝萼甲素处理后胞浆和胞核Cleaved Caspase-3的表达量均明显增加。4.蓝萼甲素抑制UMUC3细胞的PI3K/Akt信号通路4.1蓝萼甲素显著降低PI3K p85的表达水平和减少了 AktSer473位点的磷酸化水平。但PTEN水平则随着蓝萼甲素药物浓度升高而上调,而总Akt的表达量无显著性差异。4.2细胞免疫荧光实验也证实了 p-Akt(Ser473)蛋白在细胞质和细胞核的表达均有降低趋势。5.通过体内实验证明蓝萼甲素对UMUC3细胞的抗肿瘤作用5.1为了评价蓝萼甲素在体内的抗肿瘤作用,我们成功建立了 UMUC3皮下移植瘤的NOD/SCID小鼠模型。5.2用蓝萼甲素(20 mg/kg)处理的小鼠皮下移植瘤体积明显小于对照组的肿瘤体积。对照组的肿瘤平均重量为(3.73 ±0.68)g,而蓝萼甲素组的肿瘤平均重量为(1.71 ± 0.42)g。5.3在组织学水平上,我们分别选择了 Ki-67和CD31这两个指标来评价蓝萼甲素对细胞增殖和微血管密度的影响。蓝萼甲素均可明显抑制移植瘤组织中Ki-67和CD31的表达水平。结论1.蓝萼甲素抑制人膀胱癌细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性。2.蓝萼甲素通过Cdc25C/Cyclin B1/CDK1通路引起UMUC3细胞周期阻滞在G2/M期。3.蓝萼甲素通过线粒体途径诱导UMUC3细胞凋亡。4.蓝萼甲素通过抑制UMUC3细胞的PI3K/Akt通路诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡。5.蓝萼甲素有可能成为一种通过靶向PI3K/Akt通路治疗膀胱癌的药物。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：

２．２蓝萼甲素抑制ＵＭＵＣ３细胞的增殖及计算半数抑制浓度（ＩＣ５０）??用不同浓度蓝萼甲素（０、２．５、５、１０或４０?ｐＭ）处理ＵＭＵＣ３细胞后，蓝??萼甲素呈时间和剂量依赖性的抑制ＵＭＵＣ３细胞的活力（图１－２）。蓝萼甲素作??用?ＵＭＵＣ３?细胞?２４、４８、７２?和?９６?小时后?ＩＣ５０?值分别为?１８．８７、９．７７、６．７５?和?５．４０??｜ｉＭ〇??９??

我们利用平板克隆形成实验进一步证实了蓝萼甲素对ＵＭＵＣ３细胞的抑制??增殖作用。与对照组相比，蓝萼甲素对ＵＭＵＣ３细胞集落形成的数量和大小均呈??现浓度依赖的明显抑制作用（图１－３）。??１０??

我们用免疫印迹法测定Ｇ２／Ｍ期相关的周期蛋白。结果表明蓝萼甲素可引??起ｐ２１ＷＡＦ１／ＯＰ１蛋白表达水平上调，但同时下调了?Ｃｙｃｌｉｎ?Ｂｌ、ＣＤＫ１和Ｃｄｃ２５Ｃ??蛋白表达水平（图２－２）。以上这些结果表明蓝萼甲素通过剂量依赖的方式引起??ＵＭＵＣ３细胞生长阻滞在Ｇ２／Ｍ期。??Ａ?ＧＬＡ（ｎＭ）?０?２０?４０?Ｂ??１－?￣￣？二―．二￣￣??２．５ｈ?＊??Ｐ２１?ｍｍ?ｍｍ?２?ｉ?＾Ｃｏｎｔｒｏｌ?????２．（Ｔ?｜?ＥＳ３?２０ｊｉＭ??ＣＤＫ１?ｍｍｍｍｒｎ?ｍ?．２?Ｂ?４０＾Ｍ??，?ｉ?＞?５＇?ｇ｜?＊ｐ＜〇．〇ｓ??ＣｙｅＵｎｍ?Ｍｌ?ｉＭｂ?ｔ?＾?Ａ％?＾????ｉ?ｉ＾ｉ?ＩＬ?ｉ＊??Ｐ＿ａｃｔｍ?°?ｐ２１?ＣＤＫ１?Ｃｙｃｌｉｎ?Ｂ１?Ｃｄｃ２５Ｃ??图２－２免疫印迹法分析ＵＭＵＣ３细胞周期相关蛋白的表达??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?（Ａ
【参考文献】

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1 徐卫东;王平;张建平;董德平;;膀胱癌组织中生存素与细胞核增殖抗原的表达及其临床意义[J];中华实验外科杂志;2015年11期

2 王甜甜;韩倩倩;周新强;朱艳琴;;中药抗肿瘤作用的研究进展[J];中国医疗前沿;2013年13期

3 韩苏军;张思维;陈万青;李长岭;;中国膀胱癌发病现状及流行趋势分析[J];癌症进展;2013年01期

4 黄冬梅;刘保林;刘康;;蓝萼甲素研究进展[J];中国民族民间医药;2011年08期

5 万继英;韩庶勇;;肿瘤实验动物模型的建立及应用研究进展[J];医学综述;2009年19期

6 王平;董德平;陈莉;张剑平;曹斌;;Survivin、Ki67在膀胱癌中的表达及其临床意义[J];中华实验外科杂志;2006年06期

7 曹露晔,陈子君;蓝萼香茶菜研究进展[J];云南中医中药杂志;2004年03期

本文编号：2852638