桦褐孔菌三萜对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性及其有效成分鉴定

发布时间：2020-10-23 08:18

　　 为探索桦褐孔菌(Inonotus obliquus)三萜是否能作为α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶天然抑制剂,采用硅胶柱色谱洗脱桦褐孔菌提取物,通过薄层色谱检测进行分离、纯化,结合液质联用色谱和核磁共振波谱对桦褐孔菌中的生物活性物质进行鉴定。结果表明:从桦褐孔菌发酵菌丝体中发现了桦褐孔菌萜D、lawsaritol和白桦脂酸,并从子实体中得到羊毛甾醇、桦褐孔菌醇和栓菌酸;桦褐孔菌子实体中的桦褐孔菌醇对α-葡萄糖苷酶具有最强抑制活性,液体深层发酵产物桦褐孔菌萜D对α-淀粉酶具有最强抑制活性,其IC_(50)值均低于阳性对照的阿卡波糖;酶抑制动力学结果表明,桦褐孔菌醇对α-葡萄糖糖苷酶作用机制为竞争性抑制,桦褐孔菌萜D对α-淀粉酶的抑制类型为非竞争性与竞争性抑制混合。
【部分图文】：

微生物发酵一般呈S型生长,依次经历适应期、对数生长期、平衡期和衰亡期4个阶段[27]。桦褐孔菌的液体发酵生长曲线如图1所示。由图1可知,桦褐孔菌在发酵初期处于适应期,菌丝体由种子培养基接种到发酵基础培养基中需要适应新的营养环境,但由于种子培养基和发酵基础培养基的组成成分相近,因此之后很快进入对数生长期;在2～5 d,菌丝体适应新环境后,开始大量快速繁殖,呈现出对数生长状态;发酵5 d以后菌丝体生长速度下降,达到平衡期;随着发酵液中还原糖的消耗、代谢产物积累,菌丝体量与第9 d开始出现下降趋势,进入衰亡期;在前8 d的液体深层发酵中,发酵液的pH值随着发酵的进行而急剧下降之后有所回升,其原因可能是发酵后期代谢产物积累及菌体衰亡导致;发酵9 d以后发酵液中葡萄糖浓度下降到3.6 mg/mL,菌体基本停止生长;发酵9 d对桦褐孔菌生物量积累是最佳周期,生物量为9.3 g/L;三萜化合物属于桦褐孔菌的次级代谢产物,从第1～9 d,桦褐孔菌菌丝体总三萜产量随着培养时间的增加而上升,且在第3～5 d快速积累,第6 d开始菌丝体总三萜产量增加缓慢,到达第9 d三萜产量达到最大,为628.4 mg/L。2.2 菌丝体分段物抑酶活性

表1 分段物的得率、三萜含量及对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性抑制 分段物 得率/% 三萜含量/% α-葡萄糖苷酶IC50/(mg·mL-1) α-淀粉酶IC50 /(mg·mL-1) 分段物1 28.87 31.6 34.12±2.63g >100 分段物2 19.50 39.9 >100 >100 分段物3 4.08 34.1 >100 >100 分段物4 9.40 78.8 1.33±0.02c 7.86±1.55a 分段物5 3.88 82.1 9.61±0.06f >100 分段物6 1.94 73.9 36.49±3.68g >100 分段物7 2.29 62.2 1.52±0.03d 15.59±2.64b 分段物8 4.02 76.5 0.26±0.02a 8.88±0.86a 分段物9 8.75 50.5 3.32±0.03e >100 分段物10 8.00 70.2 >100 >100 阿卡波糖 — — 0.37±0.01b 10.51±0.72a 注:同列不同小写字母表示α-葡萄糖苷酶抑制活性存在显著差异,p<0.05。2.3 子实体三萜单体抑酶活性

在桦褐孔菌菌丝体提取分段物和子实体提取单体中,化合物2对α-葡萄糖苷酶具有最强抑制效果,分段物4对α-淀粉酶的抑制效果最好。在不同浓度化合物2作用下酶动力学图如图4(a)所示。由图4(a)可知,随着化合物2的质量浓度的增大,双倒数直线与横坐标的交点变大,与纵坐标的交点不变,表明米氏常数Km增大,反应最大速率Vmax不变。表明化合物2对α-葡萄糖苷酶的抑制方式属于竞争性抑制。图4(b)表明,采用双倒数法确定分段物4对α-淀粉酶的抑制方式属于非竞争性与竞争性混合型抑制,与目前市售α-葡萄糖糖苷酶/α-淀粉酶主要抑制剂阿卡波糖类似,对α-葡萄糖糖苷酶作用机制为竞争性抑制,对胰α-淀粉酶的抑制类型为非竞争性与竞争性抑制混合类型[28-29]。表2 子实体中3个化合物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性抑制 化合物 α-葡萄糖苷酶IC50/(mg·mL-1) α-淀粉酶IC50 /(mg·mL-1) 化合物1 0.60±0.01d 9.51±0.74a 化合物2 0.15±0.02a 14.31±0.71b 化合物3 0.43±0.09c >100 阿卡波糖 0.37±0.01b 10.51±0.72a 注:同列不同小写字母表示α-淀粉酶抑制活性存在显著差异,p<0.05。
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