青藤碱抑制人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的作用及机制研究

发布时间：2020-10-23 11:02

　　 人脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性原发性肿瘤,是癌致死的主要原因之一。胶质瘤患者手术和放疗后均需要化疗。但是,常规的化疗对人脑胶质瘤的治疗效果并不理想,这可能是由于肿瘤细胞抗凋亡表型的存在。同时,胶质瘤细胞所具有的高度侵袭和迁移的能力也使其可以频繁地转移到肿瘤周围组织,促进肿瘤的复发,由此很大程度上导致了胶质瘤患者的不良预后。因此,开发能够有效抑制人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的药物,尤其是可以通过半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)非依赖性途径作用的药物是非常必要的科研工作。自噬是将细胞质中异常的细胞器和蛋白质传递给溶酶体进行降解,以维持细胞内稳态的过程。自噬对于不同的肿瘤细胞刺激物或者不同类型的肿瘤细胞而言,其生物效应也是不同的。虽然如此,许多研究已经证实,一些天然产物或者癌症治疗药物可以通过激活自噬途径,诱导肿瘤细胞caspase非依赖性死亡,以及抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。活性氧簇(ROS)堆积、蛋白激酶B(Akt)-雷帕霉素的哺乳动物靶标蛋白(mTOR)信号通路的抑制、c-JunNH2-末端激酶(JNK)信号通路的活化、内质网(ER)应激以及核转录因子EB(TFEB)蛋白的激活都与自噬-溶酶体途径的调节相关。自噬除了可以诱导肿瘤细胞死亡外,还可以逆转肿瘤细胞上皮间质转化(EMT),从而抑制肿瘤的转移。同时,基质金属蛋白酶(MMP)通过降解细胞外基质(ECM),在肿瘤细胞侵袭的过程中发挥重要作用。肿瘤细胞所处的炎性微环境也是促进其侵袭和迁移的重要原因之一。青藤碱是传统中药青风藤[Sinomeniumacutum Rehd.et Wils.(Fam.Menispermaceae)]中主要的生物碱类活性成分,由于其抑制免疫和抗炎的作用,在临床上被广泛地应用于治疗类风湿性疾病。盐酸青藤碱(SH)是青藤碱的盐酸盐。最近,青藤碱的抗肿瘤作用越来越受到国内外相关学者的关注,其分子机制与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和迁移、促进肿瘤血管正常化、抗肿瘤多药耐药以及协同用药增强疗效相关。此外,青藤碱在实验研究中对中枢神经系统的疾病,如焦虑症、阿尔茨海默病、帕金森病、缺血再灌注脑损伤和实验性自身免疫性脑脊髓炎,均具有良好的改善作用。本课题组前期研究成果,以SH为主要成分的新药CQ复方,其对神经源性疼痛和癌性疼痛均具有显著的镇痛效果。因此,本文旨在明确SH对于中枢神经系统的肿瘤-人脑胶质瘤是否具有治疗作用,是否可以抑制人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移,并阐明其相关的作用机制。本研究从整体水平、组织和细胞水平、亚细胞和分子水平,系统地探讨了是否SH能够抑制人脑胶质瘤细胞增殖及其可能的干预途径。结果显示:(1)SH能够剂量依赖性地降低人脑胶质瘤细胞U87和SF767的细胞存活率,增加乳酸脱氢酶(LDH)的释放量,减少肿瘤细胞的集落形成,对正常神经胶质细胞无显著毒性。(2)SH能够剂量依赖性地降低细胞周期蛋白(cyclin)Dl、cyclinD3、cyclin E和细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)4的表达水平,提高p21和p27的表达水平,使U87和SF767细胞的G0/G1期分布增多。(3)SH作用于U87和SF767细胞,未见显著的Annexin V-FITC染色单阳细胞的增多及caspase-3的剪切;caspase抑制剂对于SH介导的人脑胶质瘤细胞存活率降低无影响。(4)SH增加了 U87和SF767细胞内酸性囊泡、自噬溶酶体的数量,提高了微管相关蛋白轻链3B(LC3B)-II的表达水平;溶酶体抑制剂增强了 SH介导的LC3B-Ⅱ表达水平提高,自噬相关基因沉默抑制了 SH介导的LC3B-Ⅱ表达水平增强,同时,自噬抑制逆转了 SH介导的U87和SF767细胞的细胞存活率下降,自噬激动促进了 SH介导的U87和SF767细胞的细胞存活率降低。(5)SH提高了 U87和SF767细胞内ROS水平,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)逆转了 SH介导人脑胶质瘤细胞内ROS的堆积、LC3B-Ⅱ和自噬相关蛋白(ATG)5的表达提高,以及细胞存活率的下降。(6)SH降低了 U87和SF767细胞内Akt-mTOR信号通路相关蛋白分子的表达水平,提高了 JNK通路相关信号分子的表达水平。同时,Akt特异性激动剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)预处理后,逆转了 SH诱导的人脑胶质瘤细胞内Akt-mTOR信号通路相关蛋白分子的表达抑制以及LC3B-Ⅱ的表达水平提高。JNK特异性抑制剂SP600125预处理后,逆转了 SH诱导的人脑胶质瘤细胞内JNK信号通路相关蛋白分子和LC3B-Ⅱ的表达水平提高。(7)NAC预处理后,逆转了 SH介导的人脑胶质瘤细胞内Akt-mTOR途径相关信号分子的表达水平降低以及JNK途径相关信号分子的表达水平提高;IGF-1以及SP600125预处理后,对SH介导的人脑胶质瘤细胞内ROS的堆积无影响。(8)SH能够增加U87和SF767细胞内溶酶体的数量,提高溶酶体标志蛋白的表达水平,降低细胞质内转录因子EB(TFEB)蛋白的表达水平,提高细胞核内TFEB蛋白的表达水平。(9)SH剂量依赖性地降低了 U87细胞异种移植瘤的瘤体积、瘤重,且对裸鼠体重无显著影响,并在体内实验中干预了与体外实验研究中相一致的信号分子。本研究从整体水平、组织和细胞水平、亚细胞和分子水平、基因水平,系统地探讨了是否SH能够抑制人脑胶质瘤细胞侵袭、迁移及其可能的干预途径。结果显示:(1)SH剂量依赖性地抑制了 U87和SF767细胞侵袭、迁移。(2)SH剂量依赖性地降低了 U87和SF767细胞内MMP-2/-9 mRNA和MMP-2/-9蛋白的表达水平。同时,SH提高了 U87和SF767细胞内核因子kappa B(NFκB)p65和NFκB抑制蛋白(IκB)-α的结合能力,降低了 P-IκB激酶(IKK)p、P-IκB-α、NFκB p65的表达水平。NFκB p65过表达逆转了 SH介导的人脑胶质瘤细胞内MMP-2/-9的表达水平以及细胞侵袭能力的降低。(3)SH增加了人脑胶质瘤细胞 二内Ca2+的浓度以及ER应激相关蛋白分子的表达水平。SH提高了 U87和SF767细胞内自噬溶酶体的数量和LC3B-Ⅱ的表达水平,同时,降低了间质样标志蛋白vimentin、Slug和Snail的表达水平。CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)同源蛋白(CHOP)或者ATG5沉默逆转了 SH介导人脑胶质瘤细胞内LC3B-ⅡⅡ的表达水平提高以及间质样标志蛋白分子的表达水平降低。4-苯丁酸(4-PBA)或者3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理后,逆转了 SH介导人脑胶质瘤细胞内自噬溶酶体数量的增加以及细胞侵袭能力的降低。(4)SH逆转了体外实验中模拟炎性微环境所诱导的U87和SF767细胞内间质样标志蛋白vimentin、Slug、Snail的表达水平以及细胞侵袭能力的提高。(5)SH在体内实验中干预了与体外实验研究中相一致的信号分子。结论Ⅰ:本研究首次提出SH在体内和体外实验中能够抑制人脑胶质瘤细胞增殖的作用,并阐明了 SH可以诱导肿瘤细胞自噬性死亡的新机制。主要的研究结论如下:(1)SH能够诱导人脑胶质瘤细胞G0/G1期阻滞;(2)SH能够选择性地诱导人脑胶质瘤细胞自噬性死亡,而非凋亡;(3)SH能够通过促进ROS堆积,抑制Akt-mTOR信号通路以及激活JNK信号通路,诱导人脑胶质瘤细胞自噬;(4)SH可能通过诱导TFEB核易位,促进人脑胶质瘤细胞内溶酶体的生物合成;(5)SH能够抑制U87细胞异种移植瘤的生长,且在给药期间对裸鼠本身未见显著毒副作用。Ⅱ:本研究首次提出SH能够抑制人脑胶质瘤细胞侵袭和迁移,其相关分子机制主要为:(1)通过钝化NFκB,抑制人脑胶质瘤细胞内MMP-2/-9的表达;(2)通过诱导ER应激介导的自噬,逆转人脑胶质瘤细胞内源性的EMT;(3)通过逆转肿瘤炎性微环境诱导的人脑胶质瘤细胞内外源性的EMT,降低肿瘤细胞的侵袭能力。综上所述,本研究提示青藤碱有潜力作为一种新的抗人脑胶质瘤细胞增殖,侵袭和迁移的候选药物,并为进一步开发青藤碱成为治疗人脑胶质瘤的临床用药提供了理论依据,同时,为有效治疗人脑胶质瘤的药物开发提供了新的参考。
【学位单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：

为了进一步阐明ＲＯＳ对ＳＨ介导的人脑胶质瘤细胞死亡的影响，我??们进行了?ＣＣＫ－８实验。结果表明，经ＮＡＣ预处理后，可以显著逆转ＳＨ介导的??Ｕ８７和ＳＦ７６７细胞的细胞存活率下降（图３Ｅ）。??综上所述，这些结果提示，ＳＨ能够显著提高Ｕ８７和ＳＦ７６７细胞中ＲＯＳ的??７ＪＣ平，并且ＲＯＳ是ＳＨ介导的人脑胶质瘤细胞自噬性死亡的上游信号分子。??６８??

图４后续??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｃｏｎｔ．??

?此外，我们还研宄了?ＪＮＫ信号通路是否也参与了?ＳＨ介导的人脑胶质瘤细??胞自噬。如图４Ａ所示，ＳＨ剂量依赖性地上调了?Ｕ８７和ＳＦ７６７细胞内Ｂｅｃｌｉｎ－１、??Ｐ－Ｂｃｌ－２和Ｐ－ＪＮＫ１的表达水平。ＪＮＫ抑制剂ＳＰ６００１２５预处理后，显著减弱了?ＳＨ??介导的两种人脑胶质瘤细胞系中Ｂｅｃｌｉｎ－１、ＬＣ３Ｂ－ＩＩ和Ｐ－ＪＮＫ１表达水平的提高??（图４Ｃ）。这些结果提示，ＳＨ诱导的人脑胶质瘤细胞自噬需要ＪＮＫ信号通路的??活化。??综上所述，ＳＨ能够诱导人脑胶质瘤细胞自噬，归因于ＪＮＫ信号通路的活化??以及Ａｋｔ－ｍＴＯＲ信号通路的抑制。??Ａ?Ｕ８７?ＳＦ７６７??Ｐ－Ａ？?一讀??Ａｋｔ?Ａｋｔ?麵＿?ｍｍｍ?ｒｎｔｓｍ?ｍＭｆｅ??决一把??？?Ｐ－ｍＴＯＲ?”丨…＂＿＿＿?ｖｍｒｎｍｍｍ?＿＿＿＿??Ｐ－ｍＴＯＲ?ｙｉ：?．一?：，一?－一…。??ｍＴ〇Ｒ?？ｒ－ｒｆ?ｒ—－?－—－？?－?ｍＴ０Ｒ?ｒ；ｆｗ？Ｓ＃ｅｒ?．?ｗｍ＾ｍ??？懸＿?？麵麵―Ｈｉ＃?，一麵??Ｐ－４Ｅ－ＢＰ１?４＞ｍ?＾?ｍｍ?－？？?Ｐ＾Ｅ－ＢＰ１?ｍｍｍ??＝?＿＿＿?＝?：＝、：；露画薦??ｊｎｋ２?樣零擎＿?修，？?ｊｎｋ２?ＷＫｔＨＨｔ＇?ＩＷｉｊｌｉｆ?＿ＨＷ?賴＿９｜１１??ＪＮＫ１?一—?？通貫一，＿…剛—ｗｗ?ｊｎｋｉ
【参考文献】

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本文编号：2852950