柴胡质量评价方法及其对肝脏功能影响研究

发布时间：2020-10-23 14:10

　　 选题依据:柴胡为常用中药材,具有解表退热、舒肝解郁、升提阳气等功效。虽然药典中明确规定药材的药用部位为根,但随着柴胡药材价格的一路走高,市场上流通的柴胡商品药材及饮片中均有不同程度非药用部位(茎叶部分)的掺入。非药用部位的掺入对柴胡质量有何影响?柴胡的药用部位和非药用部位化学成分的差异程度有多大?药典中除收载柴胡药材及其净片,还收载了醋制品。课题组前期研究发现柴胡醋制后化学轮廓发生了很大变化,但其尚无专属质量控制指标。柴胡传统功效是对肝脏的功能性作用,现代药理研究表明柴胡对肝脏具有保护作用,但使用不当还有肝损伤作用。柴胡的用量或配伍在怎样的情况下对肝脏具有保护或损伤作用?本论文针对上述问题,采用代谢组学技术比较柴胡根与茎叶、醋制品与生品的化学差异,寻找差异代谢物作为控制残茎掺入、控制醋制品质量的化学标志物,以期为柴胡质量评价和控制提供实验依据;同时探讨柴胡在常规治疗剂量下,不同配伍方剂对肝脏的影响,为柴胡的临床合理用药提供参考。目的:(1)对柴胡药用和非药用部位、柴胡生品和醋制品的化学成分进行全面表征,比较化学轮廓差异,寻找差异代谢物,为柴胡药用部位和非药用部位的区分寻找灵敏的化学标志物;为柴胡醋制品制定专属性质量控制指标,为柴胡生品与醋制品药效差异的物质基础提供实验数据。(2)明确柴胡药用和非药用部位、柴胡生品和醋制品在肝保护作用的上的差异程度。(3)探讨柴胡和含柴胡代表方剂逍遥散和小柴胡汤在治疗中对肝脏的影响。明确柴胡剂量、配伍环境和不同应用条件下对肝脏的影响。(4)明确CCl_4致大鼠慢性肝损伤动物模型的最佳造模剂量和时长,为该模型的应用提供实验基础。方法:(1)采用~1H NMR和UHPLC/ESI Q-Orbitrap HRMS两种植物代谢组学技术对柴胡药用部位(柴胡根)、非药用部位(柴胡茎叶)、柴胡醋制品进行全成分分析,对化合物进行指认与归属,结合多元统计学方法对柴胡根与茎叶、生品与醋制品进行差异性分析,寻找差异代谢物。对差异代谢物进行定性鉴定和相对定量,选取含量差别大的化合物作为柴胡药用与非药用部位区分的质量标志物。(2)采用CCl_4致小鼠急性肝损伤模型,以血清转氨酶、肝组织病理切片为指标,结合肝组织~1H NMR代谢组学研究评价柴胡根与茎叶、生品和醋制品保肝降酶功效差异;从代谢物调节数量和程度,定量描述不同柴胡的保肝药效差异。(3)测定抑郁症患者在使用逍遥散治疗前后血浆转氨酶,探讨抑郁症及肝郁状态对肝脏的损伤程度,以及柴胡在逍遥散配伍环境和治疗剂量下对患者肝脏的影响。(4)通过临床观察选取经小柴胡汤治疗有效的小柴胡汤证典型病例,对患者尿液与正常人尿液进行~1H NMR代谢组学分析对比,寻找导致小柴胡汤证患者与正常人之间的尿液产生差异的代谢物,并采用偏最小二乘回归分析(PLS)建立小柴胡汤证的预测模型。根据发生紊乱的代谢通路分析,探讨小柴胡汤证与肝脏疾病的关系,以及小柴胡汤在治疗情况下对肝脏的影响。(5)以不同剂量CCl_4给予大鼠造成慢性肝损伤模型,采用动物一般状态观察、体重、脏器外观、病理组织切片观察、血清生化检验、脏器系数作为指标,对该模型造模进行规范化研究,并采用尿液~1H NMR代谢组学分析,对该模型进行动态追踪和评价。结果:(1)采用~1H NMR和UHPLC/ESI Q-Orbitrap HRMS两种植物代谢组学技术,对柴胡根、柴胡茎叶、醋柴胡中的化学成分进行了全面分析。~1H NMR技术指认出的37个化合物主要是糖、氨基酸等初级代谢产物和柴胡皂苷a、柴胡皂苷d等含量较高的次级代谢产物。而UHPLC/ESI Q-Orbitrap HRMS指认出的32个化合物全部为植物中的次级代谢产物。~1H NMR和UPLC/ESI Q-Orbitrap HRMS两种技术分析结果显示,柴胡根和茎叶可在PCA得分图中明显分开,说明柴胡根和茎叶化学组成明显不同。差异代谢物主要属于黄酮类、苯丙素类和皂苷类化合物。其中含量差异最大的是芦丁,相差达50倍。按照《中国药典》(2015年版)四部0212药材和饮片检定通则项下的规定,将柴胡茎叶看做药屑杂质以3%(重量比)掺入柴胡根中,与没有掺入柴胡茎叶的样品在PCA散点图中可明显分开。采用~1H NMR和UPLC/ESI Q-Orbitrap HRMS两种技术分析了柴胡生品和醋制品,两种样品在PCA分析散点图中可以明显分开;~1H NMR技术和UPLC/ESI Q-Orbitrap HRMS技术分别寻找到12个和10个差异代谢物,~1H NMR技术寻找到的差异代谢物除柴胡皂苷a外均属于初级代谢产物,而UPLC/ESI Q-Orbitrap HRMS技术寻找到的全部属于次级代谢产物,主要为皂苷类和乙酰皂苷类化合物。(2)血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine amintransaminase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransaminase,AST)测定和病理组织切片观察结果表明,CCl_4组造成小鼠血清ALT和AST显著升高,显示模型复制成功;柴胡根和醋柴胡均可显著降低血清转氨酶(p0.05),具有明显的保肝作用;柴胡茎叶虽有降低ALT和AST的趋势,但与CCl_4组相比无显著性差异,表明柴胡茎叶无保肝作用;柴胡根和醋柴胡均可恢复CCl_4造成的肝组织病理损害,柴胡茎叶组肝组织病理切片与CCl_4组区别不明显。从小鼠肝组织~1H NMR图谱中指认出45个代谢物,共找到造成空白组和CCl_4组分离的差异代谢物14个,涉及能量代谢、脂质代谢、脂肪酸氧化、氧化应激、核苷代谢和氨基酸代谢等。柴胡根、柴胡茎叶和醋柴胡对差异代谢物回调的数量和程度均不相同。其肝保护作用可能与其能够回调能量代谢(包括三羧酸循环和糖酵解)、脂质代谢、氨基酸代谢和核酸代谢及谷胱甘肽等代谢途径中的代谢物有关。(3)抑郁症患者血浆ALT和AST测定结果表明,绝大多数处于正常水平范围内,一过性升高的个别患者转氨酶数值无临床诊断意义。表明抑郁症患者尚未达到肝损伤的病理表现,但治疗前26例患者出现“胸肋不适”症状,逍遥散治疗8周对转氨酶无影响,治疗后26例患者“胸肋不适”症状全部消失。(4)临床观察结果显示,小柴胡汤证患者经治疗后与肝脏相关的“右上腹部疼痛”、“肋部胀痛”、“右胁肋部刺痛”等症状均有好转或治愈,表明小柴胡汤对小柴胡汤证患者肝脏具有保护作用。小柴胡汤证患者与健康受试者尿液经OPLS-DA分析能明显分开,PLS判别模型能够准确判别小柴胡汤证患者。(5)脏器外观、脏器系数结果显示,0.02 mL CCl_4/100 g造模剂量不易累及其他系统,血清ALT和AST测定结果在2 w时开始升高到4 w时达到顶峰,到6 w时反而降低。尿液代谢组学实验结果显示,CCl_4引起了大鼠体内代谢轮廓的显著变化,且随着造模时间的延长,变化愈来愈显著。结论:(1)柴胡药材中柴胡茎叶的掺入量达3%就会对药材质量产生明显影响,表明药典对饮片的药屑杂质掺入不超过3%的规定具有合理性。另外可采用芦丁作为质量标志物控制非药用部位的掺入。柴胡非药用部位含有大量的黄酮和苯丙素类化合物,应对非药用部位进行进一步深入研究,开发其药用价值。(2)醋柴胡对CCl_4急性肝损伤的保护作用强于柴胡生品,提示临床用于保肝降酶治疗时,应首选醋柴胡。(3)虽未反映在转氨酶结果中,抑郁状态对患者肝脏功能可能已经造成了一定的影响,但尚未出现实质性损害。以疏肝健脾为主要功能主治的逍遥散在30 g/d到45 g/d的日服剂量下可以保护患者肝脏功能,且对肝脏不造成损伤。(4)小柴胡汤在正确辨证施治基础上,以柴胡计24 g/d的剂量对小柴胡汤证患者肝脏具有保护作用。(5)CCl_4致大鼠慢性肝损伤模型,造模剂量以0.02 mL CCl_4/100 g为宜,时间则以4~6周为宜。此条件下大鼠肝脏出现明显慢性损伤症状。剂量太大、时间太长不但会严重损害肝脏,还易累及其他脏器系统,造成动物的不可逆损伤引起死亡。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285;R284
【部分图文】：

绿原酸的一级、二级质谱图及其裂解规律分析

4芦丁的一级、二级质谱图及其裂解规律分析

38继而采用多元统计分析的方法进行比较，见图 3.9A。首先采用 PCA 分析，PCA可以反映数据的原始状态。由图可见，在主成分 1（t1：30.6%）和主成分 2（t2：14.2%）为坐标构建二维 PCA 得分散点图中，柴胡药用部位和非药用部位可以明显分开。其中柴胡茎叶大多位于 PCA 得分图 t[1]轴的左半边，而根和基生茎样品点位于 t[1]轴的右半边。说明柴胡含叶片的柴胡茎叶，其化学组成差异与柴胡根非常明显。值得注意的是，在柴胡根的样品点中，有一个柴胡基生茎样品点混于其中（图中标为红色）。此样品为 CH-65-J，该样品系从 CH-65 号样品（饮片）挑拣得出，而非像其他批次样品一样，由个子货样品沿芦头剪断所得。李文斌等在研究中发现，横环纹可以作为区分北柴胡根与根茎的特征[152]。但由于柴胡根和靠近根部的基生茎外观颜色和质地十分相似，切成饮片之后不一定每片饮片中都带有环横纹，极难辨认，虽经仔细挑选，
【参考文献】

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本文编号：2853139