黄连素通过p38MAPK调节骨骼肌葡萄糖代谢的机制研究

发布时间：2020-10-24 16:46

　　 目的:胰岛素抵抗(IR)是指机体靶组织,主要为骨骼肌、脂肪等外周组织对葡萄糖摄取和利用障碍,是2型糖尿病(T2DM)发病的重要机制。其中骨骼肌是利用葡萄糖和维持血糖平衡的重要组织,葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)是骨骼肌葡萄糖糖代谢的主要的葡萄糖转运体,其蛋白表达、转位和活性与胰岛素抵抗密切相关,p38MAPK信号通路通过调节GLUT4活性和转位在胰岛素抵抗发生中起重要作用。黄连素(Berberine,BBR),属于异喹啉类生物碱,多存于毛茛科黄连属植物,已有的研究表明它其具有多种药理学活性,如抗肠道细菌感染、抗心律失常、促进胰岛素的分泌、改善胰岛素抵抗等,其中改善IR与其调节GLUT4蛋白表达与活性有关,但具体作用机制还不清楚。本课题以T2DM小鼠和小鼠骨骼肌细胞C2C12模型为研究对象,采用分子对接模拟等方法研究BBR是否通过干预p38MAPK信号通路调节GLUT4的蛋白表达与活性,从而改善IR,本研究将进一步阐明BBR改善IR的作用机制,为防治T2DM提供更好的实验依据。方法:1.BBR干预骨骼肌C2C12细胞葡萄糖代谢的研究构建小鼠C2C12骨骼肌细胞系,给予不同浓度的BBR(0.25,0.5,1μmol·L~(-1))干预。葡萄糖氧化酶法检测细胞葡萄糖消耗;2-NBDG法检测细胞葡萄糖摄取;分子对接模拟预测BBR与Insulin Receptor(InsR)、GLUT1、GLUT4蛋白对接效果;Western blot检测InsR-β、GLUT1、GLUT4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达的情况;免疫荧光检测GLUT4的表达和转位。2.BBR干预高脂饲料加STZ诱导胰岛素抵抗小鼠骨骼肌葡萄糖代谢的研究选择高脂饲料加STZ腹腔注射诱导2型糖尿病胰岛素抵抗小鼠模型。造模成功后的随机分6组,即模型组、阳性对照组、BBR低、中、高剂量组、BBR中剂量配伍肉桂醛(10:1)组。正常对照组和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液,阳性对照组给予吡格列酮。灌胃给药6周,检测小鼠的空腹血糖(FBG fasting blood glucose)、血清胰岛素水平(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果:1.C2C12细胞实验结果表明(1)C2C12诱导分化成功:C2C12成肌细胞诱导分化培养4~5天,细胞形态逐渐变长,80%以上的成肌细胞可分化成多核的骨骼肌细胞。与未分化的相比,分化4天的骨骼肌细胞标志性蛋白myogenin表达明显升高,表明诱导分化成功,可用于后续实验。(2)BBR在2.5μmol·L~(-1)以下的浓度无细胞毒性:0、2.5、10、40μmol·L~(-1)浓度的BBR干预分化前后的C2C12细胞24h,发现BBR浓度为40μmol·L~(-1)时,对分化前的细胞活性没有明显影响;浓度为2.5μmol·L~(-1)时,对分化后的细胞活性没有明显影响;浓度为10、40μmol·L~(-1)时,分化后的细胞形态改变明显,因此认为BBR浓度在2.5μmol·L~(-1)以下的浓度对细胞没有毒性。(3)BBR对C2C12糖代谢影响:葡萄糖氧化酶法、2-NBDG法检测显示0.25、0.5、1μmol·L~(-1)浓度的BBR干预16h的骨骼肌细胞葡萄糖消耗量、葡萄糖摄取显著增加,说明BBR能促进骨骼肌细胞糖代谢。(4)BBR对GLUT4分子对接模拟结果:BBR与GLUT4产生π-π键相互作用,同时与Insulin Receptor、GLUT1可以结合产生氢键作用,说明BBR可能有很好的活性;BBR与Insulin Receptor、GLUT1、GLUT4对接打分分别为-5.370、-8.117、-7.274,说明BBR能够与GLUT1、GLUT4结合。(5)BBR对GLUT4及p38MAPK的磷酸化水平的影响:研究发现BBR抑制了InsR-β的表达,对GLUT1、GLUT4蛋白表达没有影响,但可以刺激GLUT4从细胞核转位至细胞膜,同时BBR增加了p38MAPK的磷酸化水平。2.在体动物实验结果表明(1)造模组C57BL/6J小鼠喂养45%高脂饲料8周后,腹腔注射STZ120mg/kg,72h后测小鼠FBG,以FBG≧11.1mmol/L为标准筛选出45只T2DM小鼠模型,分成6组用于后续实验。(2)黄连素能够降低T2DM小鼠的血糖、血清胰岛素水平,改善胰岛素抵抗,而且黄连素配伍肉桂醛的降糖效果优于黄连素单独给药。结论:1.BBR可以促进骨骼肌细胞糖代谢,刺激GLUT4从细胞核向细胞膜转位,可能通过抑制InsR-β的表达、提高p38MAPK磷酸化水平实现的。2.BBR可以改善T2DM小鼠的胰岛素抵抗,配伍肉桂醛后作用更强。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

黄连素通过 p38MAPK 调节骨骼肌葡萄糖代谢的机制研究三、实验结果（一）C2C12 骨骼肌细胞的培养及分化为了验证 C2C12 成肌细胞分化成骨骼肌细胞，并且能够用于后续的实验，本研究采用了实时动态监测成像拍照观察期其形态学变化以及Western Blot法检测 0 天和分化 4 天后 C2C12 细胞中肌细胞生成素 myogenin[57]的蛋白表达情况。实时动态监测成像结果表明，C2C12 成肌细胞诱导分化 0 天，细胞形态为星型或者多边形，换成诱导分化液培养后，细胞之间相互融合，细胞形态由原来的星型或者多边形逐渐变成圆形，随着分化时间延长，逐渐出现短条状的肌管，分化 4 天后 80%以上的成肌细胞可分化成长条状、多核的骨骼肌细胞（见图 1-1 A、B）。Western blot 结果表明，myogenin 在未分化的 C2C12 成肌细胞中基本未表达，诱导分化 4 天后，骨骼肌细胞中 myogenin 表达明显升高，表明诱导分化成功，可用于后续实验（见图 1-1 C）。

广州中医药大学 2018 届硕士学位论文实时动态检测成像拍照结果表明，用 0、2.5、10、40μmol·L-1浓度的黄连素干预分化前、后的 C2C12 细胞 24h，黄连素浓度为 0~40μmol·L-1时，分化前的细胞形态没有明显改变（见图 1-2A-D）；浓度为 0~2.5μmol·L-1时，分化后的细胞形态没有明显影响（见图 1-2 E、F）；但浓度为 10、40μmol·L-1时，分化后的细胞形态发生明显改变，长条肌管形态边界模糊，细胞核易见（见图 1-2 G、H）。因此认为黄连素浓度在 40μmol·L-1以下对 C2C12 成肌细胞形态没有影响，浓度在 2.5μmol·L-1以下对 C2C12 骨骼肌细胞形态没有影响。

1-3.黄连素对 C2C12 骨骼肌细胞葡萄糖消耗的影响（x±se，n=注：与正常组相比，**P<0.01.1-3 Glucose consumption in C2C12 myotubes（**P<0.01 vs cont连素对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响测黄连素对正常 C2C12 骨骼肌细胞的葡萄糖摄取功能的影响BDG 法，用实时动态监测仪拍照，检测黄连素（0.25、0.5、112 骨骼肌细胞 16h 后，细胞对葡萄糖的摄取情况。实时动态，黄连素（0.25、0.5、1μmol·L-1）干预 C2C12 骨骼肌细胞 1色荧光强度极弱（见图 1-4A），与正常组相比，0.25、0.5、连素组的绿色荧光强度均有所增强，且 1μmol·L-1时绿色荧光-4 B-D），结果表明黄连素能够促进 C2C12 骨骼肌细胞对葡萄
【参考文献】

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本文编号：2854727