化瘀祛痰方对FFA诱导HepG2细胞脂质沉积的影响及机制研究

发布时间：2020-10-26 02:04

　　 论文一化瘀祛痰方对FFA诱导Hep G2细胞脂质沉积及自噬的影响目的:采用血清药理学方法观察化瘀祛痰方对FFA诱导Hep G2细胞脂质沉积及自噬水平的影响,探讨化瘀祛痰方防治高脂血症的可能作用机制。材料与方法:以摩尔比2:1不同终浓度油酸和棕榈酸的混合液诱导培养Hep G2细胞24h,采用CCK-8、油红O染色与光电比色法筛选出建立最佳Hep G2细胞脂质沉积模型的诱导浓度;采用CCK-8法确定各组大鼠含药血清作用度;实验分为4组:空白对照组、模型组、化瘀祛痰方组和辛伐他汀组,采用油红O染色和光电比色法观察化瘀祛痰方对FFA诱导Hep G2细胞脂质沉积的影响,采用Western Blot法检测化瘀祛痰方对自噬相关指标Atg3与Atg5的影响。结果:1.CCK-8法显示,经不同终浓度油酸和棕榈酸混合液诱导24h后,当其终浓度超过1mmol/L时对Hep G2细胞活力的抑制率较大。2.与胎牛空白血清组相比,经浓度分别为5%、10%、15%的大鼠空白血清、化瘀祛痰方含药血清及辛伐他汀含药血清培养48h后,10%含药血清浓度对细胞活力影响最小。3.油红O法显示,与空白对照组相比,模型组细胞内脂滴形成显著增多;与模型组相比,辛伐他汀组、化瘀祛痰方组细胞内脂滴形成显著减少。4.光电比色法显示,与空白对照组相比,模型组细胞内TG含量显著增多(p0.05);与模型组相比,辛伐他汀组、化瘀祛痰方组细胞内TG含量显著降低(p0.05)。5.Western Blot法显示,3h:与模型组比较,化瘀祛痰方组Atg3与Atg5表达显著增加(p0.05);6h:与空白对照组相比,模型组Hep G2细胞内Atg3与Atg5表达显著增加(p0.05),与模型组比较,化瘀祛痰方组Atg3与Atg5表达显著增加(p0.05);12h:各组间Atg3与Atg5表达含量无显著差异。结论:1.Hep G2细胞经浓度1mmol/L油酸和棕榈酸(摩尔比2:1)混合液作用24h后能成功复制脂质沉积模型。2.化瘀祛痰方能有效改善油酸和棕榈酸混合液诱导Hep G2细胞脂质沉积的水平。3.化瘀祛痰方可能通过上调Hep G2细胞自噬水平有效降低油酸和棕榈酸混合液诱导Hep G2细胞脂质沉积的水平。论文二化瘀祛痰方通过抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路减轻FFA诱导的Hep G2细胞脂质沉积目的:基于PI3K/AKT/m TOR信号通路探讨化瘀祛痰方减轻FFA诱导Hep G2细胞脂质沉积的可能作用机制。材料与方法:体外培养Hep G2细胞,随机分为5组:正常对照组、模型组、LY294002组、化瘀祛痰方组、化瘀祛痰方联合LY294002组。采用油红O染色和细胞内TG含量测定法检测各组Hep G2细胞脂质沉积情况;采用免疫荧光细胞化学染色法观察各组LC3B的表达;采用Western Blot法检测各组p-AKT、p-m TOR、LC3A/B、SREBP-1c的水平;采用Q-PCR法检测SREBP-1c、LC3B m RNA表达水平。结果:1.油红O法显示,与正常对照组相比,模型组细胞内的脂滴呈明显增多趋势;与模型组相比:LY294002组细胞内的脂滴无显著变化,化瘀祛痰方组、化瘀祛痰方联合LY294002组的脂滴明显减少。2.光电比色法显示,与正常对照组相比,模型组细胞内TG含量显著增加(P0.05);与模型组相比:LY294002组细胞内TG含量无显著变化,化瘀祛痰方组、化瘀祛痰方联合LY294002组TG含量显著减少(P0.05)。3.免疫荧光法显示,正常对照组和LY294002组细胞LC3B呈微弱表达,模型组呈阳性表达,化瘀祛痰方组、化瘀祛痰方联合LY294002组LC3B呈强阳性表达。4.Western Blot法显示,与正常对照组相比,模型组p-AKT、p-m TOR蛋白水平显著降低(p0.05),SREBP-1c蛋白、LC3B蛋白表达水平显著升高(P0.05);与模型组相比,LY294002组p-AKT、p-m TOR、LC3B蛋白水平显著降低(p0.05),SREBP-1c蛋白表达无显著变化,化瘀祛痰方组及化瘀祛痰方联合LY294002组p-AKT、p-m TOR、SREBP-1c蛋白水平显著降低(p0.05),LC3B蛋白表达水平显著升高(P0.05)。5.Q-PCR法显示,与正常对照组相比,模型组细胞内SREBP-1c、LC3B m RNA表达水平显著升高(P0.05);与模型组相比,LY294002组SREBP-1c m RNA表达水平无显著变化,LC3B m RNA表达水平显著降低(P0.05),化瘀祛痰方组和化瘀祛痰方联合LY294002组SREBP-1c m RNA显著降低(P0.05),LC3B m RNA表达水平显著升高(P0.05)。结论:1.化瘀祛痰方有效改善油酸和棕榈酸混合液诱导Hep G2细胞脂质沉积水平的机制可能与抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白表达有关。
【学位单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

化瘀祛痰方对 FFA 诱导 HepG2 细胞脂质沉积的影响及机制研究实验结果积 HepG2 细胞模型最佳诱导浓度确定养细胞进行形态观察发现，油酸和棕榈酸混合液作用24h后，其终浓度1mm浮细胞较少。CCK-8 实验结果，见图 1，当其终浓度超过 1mmol/L 时 OD对细胞活力的抑制率较大。细胞经油红 O 染色后光学显微镜观察可见，对清晰，胞浆丰富，细胞内未见红色脂滴；实验组则随着诱导剂浓度的增加滴呈递增趋势，当诱导剂浓度等于 1mmol/L 脂滴形成最多，且细胞状态良浓度大于 1mmol/L 时，部分细胞漂浮，脂滴形成开始减少，当诱导剂浓度 时，细胞数量显著减少，无明显脂滴形成，见图 2。结合 CCK-8 实验结果为 1mmol/L 的油酸和棕榈酸混合液作为最佳作用浓度。

剂浓度大于 1mmol/L 时，部分细胞漂浮，脂滴形成开始减少，当诱导剂浓/L 时，细胞数量显著减少，无明显脂滴形成，见图 2。结合 CCK-8 实验结度为 1mmol/L 的油酸和棕榈酸混合液作为最佳作用浓度。图 1 CCK8 法观察不同终浓度油酸和棕榈酸混合液对 HepG2 细胞活力的

质沉积模型特征，见表 1。 1mmol/L的油酸和棕榈酸混合液诱导24h后的各组HepG2细胞内TG 含量及培养液ST、ALT 含量变化检测指标 空白对照组 模型组TG(mmol/L) 1.26±0.18 7.6±0.69*AST(U/L) 7.69±0.48 8.04±0.39ALT(U/L) 5.57±0.31 5.99±0.57.05 vs 空白对照组；瘀祛痰方对脂质沉积 HepG2 细胞模型的影响CCK-8 法确定含药血清无毒性给药浓度与胎牛血清对照组相比，经浓度分别为 5%、10%、15%的大鼠空白血清、化瘀祛痰药血清及辛伐他汀含药血清培养 48h 后，HepG2 细胞在各组 10%含药血清浓度培养长状况良好，见图 3。
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本文编号：2856324