目的:硫磺熏蒸养护方法作为一种防霉、防腐和防虫蛀的加工储藏的方法既有优点又有缺点,本课题自制硫磺熏蒸土茯苓药材并提取分离纯化得到硫磺熏蒸土茯苓粗多糖和非硫磺熏蒸土茯苓粗多糖,对两者的理化性质的改变进行一系列考察比较,重点揭示了硫磺熏蒸是否对免疫细胞造成毒性和降低土茯苓多糖免疫调节方面的药效,并探讨其作用机制,填补了硫磺熏蒸关于免疫方面的研究空白,为取消或规范化硫熏方法提供了科学扎实的依据和参考。方法:1.制备经硫磺熏蒸的土茯苓药材,经过热水回流提取、乙醇醇沉和Sevage试剂除蛋白质等方法分离纯化得到硫磺熏蒸的土茯苓粗多糖和非硫磺熏蒸的土茯苓粗多糖。2.从外观上,在超纯水、无水乙醇、甲醇、乙醚、丙酮和三氯乙酸溶剂中的溶解性,粗多糖提取率,苯酚-硫酸法测定总糖含量,元素组成分析和红外光谱等理化性质对硫磺熏蒸的土茯苓粗多糖和非硫磺熏蒸的土茯苓粗多糖进行比较分析。3.通过MTT法检测硫熏和非硫熏土茯苓粗多糖对巨噬细胞毒性的影响。4.通过ELISA试剂盒测定巨噬细胞上清培养液中分泌的TNF-α和IL-6的含量;通过RT-PCR法测定巨噬细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达,考察硫熏和非硫熏土茯苓粗多糖对巨噬细胞分泌细胞免疫相关因子的影响。5.通过CFSE增殖实验检测硫熏和非硫熏土茯苓粗多糖对原代提取的小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响。6.通过流式细胞仪检测硫熏和非硫熏土茯苓粗多糖对小鼠脾脏淋巴细胞亚群表型比例的影响。7.通过Hoechst33258对巨噬细胞细胞核进行染色、流式细胞仪检测巨噬细胞细胞凋亡率、细胞周期和线粒体膜电位的改变,考察硫熏后的土茯苓粗多糖是否促进巨噬细胞的凋亡。8.RT-PCR法检测巨噬细胞中细胞凋亡相关因子Bax和Caspase-8的mRNA表达量,Western Blot法检测MAPKS信号通路和Bax和Caspase-8的蛋白表达量,考察并探讨硫熏土茯苓粗多糖抑制免疫细胞增殖,促进细胞凋亡和降低土茯苓多糖免疫调节方面药效可能的作用机制。结果:1.土茯苓药材经过"水提-醇沉-除蛋白-冷冻干燥"等步骤后,得到硫磺熏蒸土茯苓粗多糖干燥样品(SSGRP)20.85 g,提取率为4.17%,非硫磺熏蒸土茯苓粗多糖干燥样品(NSGRP)6.35 g,提取率为1.27%。2.经过硫磺熏蒸后,土茯苓药材颜色由比较暗黄变成可明显看出色泽变白,证明通过硫磺熏蒸确实能起到药材漂白的作用。两种粗多糖样品在不同溶剂中的溶解性各有差异。3.根据苯酚-硫酸法,土茯苓粗多糖样品SSGRP和NSGRP的紫外光谱扫描均在490nm处附近测得有最大吸收峰,故采用490nm作为最大吸收波长。通过葡萄糖标准曲线方程计算测得SSGRP和NSGRP中总糖含量分别为46.43%和42.18%,硫熏后土茯苓粗多糖含量检测值增加4.25%。4.经过硫磺熏蒸后,SSGRP中硫元素的含量比NSGRP高出2倍多,碳氢元素基本一致,表明了硫磺熏蒸确实会造成二氧化硫的残留,与相关文献报道一致。5.红外光谱分析中,SSGRP与NSGRP在整体峰数、峰形、峰位上相似,但在3400-2900 cm-1之间,两者吸收峰强度有差异,推测多糖类结构可能发生改变。在波长1700-1300 cm-1之间,SSGRP峰形尖锐,且在约1652.7 cm-1处有明显左移现象。而在波长1160-900 cm-1之间,SSGRP吸收峰强度都较NSGRP弱,且峰形较尖锐,故推测经硫熏后硫氧双键结构可能发生改变。6.MTT细胞毒性实验中,SSGRP能明显降低巨噬细胞的存活率并呈浓度依赖性,在1000-8000 μg/mL浓度范围内细胞存活率从93.18 ± 1.67%下降至60.95 土1.77%,而NSGRP对巨噬细胞的增殖无明显影响,表明硫磺熏蒸使本来无毒性的土茯苓粗多糖增加了一定的细胞毒性,细胞增殖抑制作用明显。7.ELISA实验中,非硫熏的土茯苓粗多糖能增加巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α和IL-6的作用,具有免疫调节的功效,但经过硫磺熏蒸后,SSGRP组虽然仍可促进巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6因子,但分泌量明显比NSGRP组减少,具有显著地统计学意义,这说明了硫磺熏蒸会降低土茯苓粗多糖应有的免疫调节方面的药效。RT-PCR实验中TNF-α和IL-6 mRNA的表达与相应的细胞因子分泌结果相一致,表明硫磺熏蒸降低土茯苓粗多糖免疫调节方面的药效可能是通过减少细胞因子相应的基因表达来实现的。8.CFSE增殖实验说明土茯苓粗多糖本来具有促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖的功能,多数淋巴细胞已增殖到第六代,而经过硫磺熏蒸后,粗多糖的增殖作用有所减弱,多使细胞停留在第五代如空白对照组,SSGRP抑制淋巴细胞的增殖有可能降低土茯苓粗多糖免疫调节的药效。而淋巴细胞亚群表型的检测中,SSGRP和NSGRP在浓度500-2000μg/mL的范围内,并没有影响小鼠脾脏淋巴细胞亚群表型的比例,说明土茯苓粗多糖SSGRP和NSGRP对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响有可能与T细胞、B细胞和NK细胞数量上的比例无关。9.Hoechst33258细胞核染色实验说明随着硫熏SSGRP浓度的增加,细胞核出现致密浓染的亮蓝色荧光增多,存在明显的量效关系,表明SSGRP确实诱导了巨噬细胞的凋亡。10.Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡实验表明随着SSGRP药物浓度的增加,细胞凋亡率从空白对照组的15.7%上升至30.6%,细胞周期实验SSGRP处理组GO/G1期和G2/M期细胞比例的减少及S期细胞比例的增多说明硫磺熏蒸使巨噬细胞的周期停留在S期,发生S期阻滞,使其不能顺利进行DNA的复制,影响细胞进入下一次的分裂,从而截断细胞的分化再生,导致细胞凋亡。SSGRP还能使巨噬细胞的线粒体膜电位下降。上述实验结果表明土茯苓粗多糖本来没有促进巨噬细胞凋亡的作用,而经过硫磺熏蒸后的土茯苓粗多糖却增加了巨噬细胞的凋亡率,诱导其发生凋亡,说明其对巨噬细胞的增殖抑制作用是通过促进细胞的凋亡来实现的。11.荧光定量PCR和Western Blot法考察硫磺熏蒸促进巨噬细胞发生凋亡的作用机制。实验结果表明土茯苓粗多糖NSGRP的凋亡相关基因Bax和Caspase-8并未被激活,但是经过硫磺熏蒸处理后,SSGRP通过增加促凋亡蛋白Bax的基因和蛋白表达量,从而启动并激活凋亡酶Caspase-8的基因和蛋白表达,引起产生一系列的Caspase级联反应,最终导致促进巨噬细胞的凋亡。12.非硫熏的土茯苓粗多糖NSGRP能上调巨噬细胞的MAPK信号通路中磷酸化ERK和JNK蛋白的表达,而经过硫磺熏蒸后,蛋白的相对表达量均降低,说明SSGRP明显抑制了 P-ERK和P-JNK蛋白表达量的升高,对MAPK通路有抑制作用。结论:本课题的研究结果表明,硫磺熏蒸改变了土茯苓粗多糖的多种理化性质,并造成了二氧化硫的残留增多,抑制了小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠脾脏淋巴细胞两种免疫细胞的增殖和促进巨噬细胞的凋亡,使得本来无毒性的土茯苓多糖产生一定的细胞毒性,影响免疫系统的功能,另外还降低了土茯苓粗多糖原有免疫调节方面的药效,并探讨了硫磺熏蒸对土茯苓多糖造成影响的作用机制与促进凋亡相关蛋白Bax和Caspase-8基因和蛋白表达量增加和抑制MAPK信号传导通路有关。为取消或规范化硫磺熏蒸这种药材养护方法提供了科学扎实的依据和参考。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：
苓的研究进展??．１?土茯苓的概况??苳是百合科植物光叶菝葜（Ｓ’ｆｆｌｉＪａｘｇｉａｂｒａ?）的干燥根莲，为多年生??缘状的灌木，生于海拔较低的灌木丛或山坡、河谷林边的半阴地，多于夏、秋??，入药部分仅采取其干燥后的根茎，除去须根、泥沙，洗净后干燥入药，或??切成薄片，晒干入药。土茯苓主要分布于我国广东、广西、湖南、湖北、四??、陕西、甘肃、安徽、浙江、江西、福建和台湾等地［１］。??苓出自《滇南本草》，并入《本草拾遗》草禹余粮，而其名字始见于《本草??文中记载：“土茯苳，有赤白二种，入药用白者良。”其性平，气微，味微甘??。归肝胃脾经，具有凉血解毒、和中除湿及通利关节等药效。《纲目》载此药??胃，强筋骨，祛风湿，利关节。治拘挛骨痛，恶疮痈肿，解汞粉、银朱毒”。??上用于治疗梅毒及汞中毒所致的筋骨疼痛，肢体痉挛；湿热淋浊，带下，痈??，疥癣等疾病，是一味常用的中药材［Ｍ］。同时，土茯苓可当作药食同源的一??常被人们作为煲汤健脾除湿和制作龟苓膏的原料食材。??
爆??图２－１?土茯苓原药材和粗多糖样品图片??如图２－１－Ａ，左侧未经硫磺熏蒸的土茯苓药材颜色较暗黄，右侧为经过硫磺熏蒸??后的土茯苓药材，可明显看出色泽变白。图２－１－Ｂ为提取干燥后对应的非硫磺熏蒸土??茯苓粗多糖粉末（ＮＳＧＲＰ）和硫磺熏蒸土茯苓粗多糖粉末（ＳＳＧＲＰ）。分别称取１０?ｔｎｇ??样品溶于ｌｍｌ试剂，检测两种粗多糖样品在不同溶剂中溶解性的差异，如表２－３所??示，经过硫磺熏蒸后的土茯苓粗多糖样品易溶于水和三氯乙酸，呈淡乳白色，不溶于??乙醇、甲醇、乙醚和丙酮等有机溶剂中。而没有经过硫磺熏蒸的粗多糖样品在水、乙??１３??
?２．?４．?２．?２粗多糖最大吸收波长的确定??如图２－２所示，土茯苓粗多糖样品ＳＳＧＲＰ和ＮＳＧＲＰ的紫外光谱扫描均在４９０?ｎｍ??处附近测得有最大吸收峰，故采用４９０?ｎｍ作为最大吸收波长。??ＡＱ??６．０－３??５．５?ｉ??５－〇￣ｉ?柳?ｎｍ??４．５４??－ＳＳＧＲＰ?ｎ??Ｏ－Ｏ－ｌ?１?１?１￣￣?？—ｉ—￣＾?＂Ｔ?????Ｚ）０?３００?４００?５００?６００?７００?８００??Ｗａｖ?ｄ?ｅｎｇｔｈ?（ｎｍ）??图２－２?土茯苓粗多糖样品紫外光谱扫描??２．?４．?２．?３总糖含量的测定??根据苯酚－硫酸法，显色后用酶标仪测定葡萄糖标准溶液的吸光度值，根据不同??浓度的无水葡萄糖及对应的吸光度值，绘制标准曲线，得出线性回归方程为??Ｙ＝０．００２７ｘ＋０．?０７０８?（?Ｒ２＝０．?９９８３，线性范围：１．９５－１０００?阽／ｍＬ）。计算测得土茯苓粗??１４??
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 杨若明;钱文涛;刘春兰;土登彭措;;藏药延根中粗多糖提取和含量分析[J];延边大学学报(自然科学版);2006年01期
2 杨若明;钱文涛;何建荣;刘春兰;土登彭措;;藏药“喁”中粗多糖提取和含量分析[J];中央民族大学学报(自然科学版);2006年02期
3 睢大员,于晓凤,吕忠智,高普军,朴云峰,宋国培;枸杞子、北五味子和黄精三种粗多糖的增强免疫与抗脂质过氧化作用[J];白求恩医科大学学报;1996年06期
4 刘洁,孙文娟,崔玉辉,纪耀华;大黄粗多糖的初步药理研究[J];长春中医学院学报;1997年03期
5 牛艳秋,陈光,徐险峰,赵晓敏,徐世忱;吉林枸杞制药废渣中粗多糖的提取纯化与相关成分分析[J];中国中药杂志;2001年12期
6 叶振南,邵家坪,陆惠文;粗多糖的提取、分离及结构研究[J];中国药事;2000年05期
7 王燕萍;杨君;冯慧予;陆珩;;粗多糖测定方法的选择对分析结果的影响[J];中国卫生检验杂志;2009年09期
8 张雅君;梁忠岩;张丽霞;;党参粗多糖的组成及其免疫活性研究[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2012年07期
9 王婷婷;付超美;李钰婷;王欣;阳勇;于超;;麦冬粗多糖除蛋白工艺研究[J];中国新药杂志;2008年09期
10 刘苏萌;王丽娟;司艳红;何培新;;蛹虫草基质粗多糖提取及抗氧化活性测定[J];食品科技;2009年07期
相关博士学位论文 前1条
1 白日霞;马粪海胆多糖的研究[D];大连理工大学;2010年
相关硕士学位论文 前10条
1 曹楠楠;苦豆子多糖的制备及基本结构特征[D];上海交通大学;2015年
2 赵玲华;沙田柚柚子皮多糖提取分级及保润性研究[D];仲恺农业工程学院;2015年
3 张蓝艺;扇贝内脏粗多糖中重金属Cd的脱除研究[D];大连工业大学;2014年
4 陈腾腾;牡蛎粗多糖对脂多糖刺激断奶仔猪小肠健康的影响[D];福建农林大学;2014年
5 魏娜;山药块茎多糖生物活性及其机理的研究[D];内蒙古农业大学;2016年
6 辛小青;饲粮中添加苜蓿粗多糖对蛋鸡生产性能、蛋品质及免疫指标的影响[D];中国农业科学院;2016年
7 李泽秀;红稗多糖的分离纯化及其生物活性的探究[D];贵州大学;2016年
8 孙永梅;山药加工副产物中多糖的提取及活性研究[D];南昌大学;2016年
9 杨全;桑黄的液体发酵及其粗多糖抗肿瘤作用的研究[D];吉林农业大学;2002年
10 范晓艳;毛尖蘑子实体粗多糖的提取及其对H_（22）荷瘤小鼠抑瘤作用的影响[D];佳木斯大学;2010年
本文编号：
2856688
