基于线粒体凋亡通路探讨阳和汤含药血清对SD大鼠软骨细胞凋亡影响的体外实验研究

发布时间：2020-10-26 16:22

　　 目的观察阳和汤含药血清对硝普钠诱导的凋亡模型中软骨细胞促凋亡因子Bax、Caspase-9、Caspase-3和抗凋亡因子Bc1-2表达量的影响,探讨阳和汤含药血清对软骨细胞凋亡的影响。方法1.健康2月龄SPF级SD大鼠40只,雌雄不限,按“动物和人体表面积折算的等效剂量比率表”计算出大鼠每日用药剂量,予以阳和汤灌胃,一天2次(早晚各一次),连续7天,最后1天连续2次灌胃,中间间隔2h后,予以10%水合氯醛麻醉后腹主动脉取血,低温高速离心后制备含药血清。2.采用机械-酶消法消化4周龄SPF级SD大鼠膝关节和股骨头软骨组织并分离出软骨细胞,建立体外培养体系并用甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原酶鉴定。在倒置相差显微镜下观察软骨细胞生长状况。3.用1mMSNP诱导第2代软骨细胞制作退变软骨细胞模型,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化进行鉴定。4.MTT法检测阳和汤含药血清对抑制退变软骨细胞凋亡的最佳干预时间和干预浓度;流式细胞术检测细胞凋亡率;Q-PCR法检测Bax、Bc1-2、Caspase-9、Caspase-3基因表达情况;Western Blot法检测Bax、Bc1-2、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达情况。结果1.第2代软骨细胞形态大小一致、胞浆丰富、胞核清晰、生长状态良好;经甲苯胺蓝染色后,细胞核被染成深蓝色,细胞间质及胞浆均被染成淡蓝色。经Ⅱ型胶原染色后,阳性对照组胞浆区为棕黄色。采用1mMSNP诱导后的软骨细胞,形态大小不规则、核变大、胞膜胞浆不清晰、部分细胞悬浮于培养基中。2.MTT结果表明,阳和汤含药血清抑制退变软骨细胞凋亡的最佳干预浓度和干预时间分别为10%含药血清和48h。流式细胞术分析表明,阳和汤含药血清组能显著降低退变软骨细胞的凋亡率。Q-PCR和Westem-Blot法检测结果显示阳和汤含药血清组能显著降低促凋亡因子Bax、Caspase-9、Caspase-3基因和蛋白的表达量,提高抗凋亡因子Bc1-2基因和蛋白的表达量。结论阳和汤含药血清能通过降低经SNP诱导凋亡模型软骨细胞中促凋亡因子Bax及Caspase-9、Caspase-3表达,上调抗凋亡因子Bc1-2表达,有效调节线粒体凋亡通路,从而有效抑制软骨细胞凋亡,减少软骨基质降解,有利于修复软骨,为阳和汤预防和延缓OA病情提供理论依据。
【学位单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

镜下观察细胞外观形态近似圆形或卵圆形，形态大小基本一致，且遮光性强为原代??软骨细胞；接种培养４８ｈ后大多数软骨细胞开始贴壁生长，分裂增殖速度加快，形似扁??平状，胞浆丰富，胞核清晰，具有〗－２个核仁（图１－Ａ）；培养４ｄ后，软骨细胞出现成簇生??长现象，形似圆形或椭圆形，且细胞以聚集重叠生长的方式沿瓶壁扩散（图１－Ｂ）；?８ｄ后细??胞分布均匀，铺满瓶底约９０％，边界清晰，形态结构一致，呈明显的铺路石状（图１－Ｃ）；??本实验使用第２代软骨细胞因其生长状态良好，细胞形态结构一致，胞浆胞膜清晰，增??殖速度较快（图１－Ｄ）。??■Ｈ??■■??Ｃ?Ｄ??图１软骨细胞形态学特征（１００Ｘ）??３．?２软骨细胞的鉴定结果??３．２．?１甲苯胺蓝染色??如图２可见，经甲苯胺蓝染色法染色后，光镜下显示，正常软骨细胞的细胞核被染??１６??

图２甲苯胺蓝染色（１００Ｘ）??３．２．２?ＩＩ型胶原染色??如图３所示，经ＩＩ型胶原染色后，阴性对照组胞浆区颜色透明，实验组胞浆区为棕??

３．?４含药血清抑制退变软骨细胞凋亡的最佳干预时间与干预浓度??用ＭＴＴ法检测含药血清在不同浓度（５％、１０％、１５％、２０％）及不同时间（２４ｈ、??４８ｈ和７２ｈ）对退变软骨细胞凋亡的影响。如表１、图５－１所示，模型组和各浓度含药血??清组ＯＤ值均显著低于空白组，差异具有统计意义（Ｐ＜０．０１）。各浓度含药血清组ＯＤ??值显著高于模型组ＯＤ值（Ｐ＜０．０１），显著低于空白组（Ｐ＜０．０１）。各实验组间比较显示，??在干预２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ后，１０％含药血清组均显著高于５％、１５％、２０％含药血清组，差??异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。以上数据表明，阳和汤含药血清抑制退变软骨细胞凋亡??的最佳干预浓度为１０％。如表１、图５－２所示，从最佳干预浓度上观察不同干预时间结??果显示，４８ｈ组ＯＤ值显著高于２４ｈ组和７２ｈ组，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。以??上实验结果表明，阳和汤含药血清抑制退变软骨细胞凋亡的最佳干预时间和干预浓度分??别为４８?ｈ和１０％含药血清。??１８??
【参考文献】

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本文编号：2857226