β-catenin在虫草素诱导胶质瘤细胞MGMT抑制及减少替莫唑胺耐药中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-26 13:42

　　 背景:胶质瘤(glioma)是神经系统中最常见、最具侵袭性的肿瘤,同时具有恶性程度高、预后差、发病率和复发率高等特点。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是一种用于治疗恶性胶质瘤的一线化疗药物。然而,很多胶质瘤患者对替莫唑胺具有耐药性。因此,我们迫切地需要更有效的治疗方案。虫草素(cordycepin,COR)是一种具有抗肿瘤作用的天然化学物质,但其详细作用机制仍有待研究。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)能够修复受损的DNA,并且有助于胶质瘤对替莫唑胺的耐药性的产生。Wnt/β-catenin信号通路能够调控MGMT基因的表达,虫草素能够调控Wnt/β-catenin信号通路。然而,虫草素能否通过下调β-catenin通路来抑制MGMT表达,同时增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性,目前国内外尚无此方面研究。目的:本研究的目的是用胶质瘤细胞系以及移植瘤鼠模型来研究β-catenin在虫草素诱导胶质瘤细胞MGMT抑制及减少替莫唑胺耐药中的作用,并探讨其分子机制。方法：在本研究中,通过MTT法检测药物对细胞存活率的影响,通过细胞克隆实验观察虫草素对胶质瘤细胞增殖的影响,通过流式细胞学检测方法研究胶质瘤细胞的死亡方式及细胞周期的变化,通过DCFH-DA探针检测胶质瘤细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成水平的变化,通过DTNB-GSSG检测法检测胶质瘤细胞中还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量的变化,通过实时定量PCR方法检测胶质瘤细胞中MGMT m RNA表达水平的变化,通过细胞转染方法来研究MGMT和β-catenin在虫草素诱导胶质瘤细胞死亡及减少替莫唑胺耐药中的作用,通过免疫蛋白印迹法(western blotting)检测胶质瘤细胞及胶质瘤移植瘤组织中相关蛋白分子的表达水平变化,通过免疫组织化学染色法观察胶质瘤移植瘤组织中相关蛋白分子的表达水平的变化。通过建立大鼠颅内原位移植瘤模型和裸鼠皮下移植瘤模型来验证虫草素在体内实验中的作用。结果:1、MTT法检测结果表明虫草素能够降低胶质瘤细胞存活率,对正常细胞存活率影响较小。细胞克隆实验结果表明虫草素能够抑制胶质瘤细胞增殖。流式细胞学检测结果表明虫草素能够诱导胶质瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞。免疫蛋白印迹结果表明在虫草素的作用下,胶质瘤细胞中Bcl-2和Cyclin B1蛋白表达减少。同时,Bax,cleaved PARP-1和cleaved caspase-3蛋白表达增加。2、虫草素能够抑制胶质瘤细胞中MGMT基因的表达。同时,联合应用虫草素和替莫唑胺在胶质瘤细胞中具有协同作用。在胶质瘤细胞中过表达MGMT能够逆转虫草素和替莫唑胺的协同作用。在胶质瘤细胞中基因沉默β-catenin能够抑制MGMT m RNA和蛋白的表达,并且增强替莫唑胺的化疗敏感性。3、在胶质瘤细胞中,虫草素能够抑制p-GSK-3β和β-catenin蛋白的表达。GSK-3β抑制剂(CHIR-99021)或过表达β-catenin能够逆转虫草素在胶质瘤细胞中抑制MGMT表达,降低细胞存活率,诱导凋亡以及减少替莫唑胺耐药的作用。4、DCFH-DA探针检测结果表明虫草素能够诱导胶质瘤细胞ROS过度产生,DTNB-GSSG检测法的结果表明虫草素能够使胶质瘤细胞GSH的生成减少。GSK-3β抑制剂(CHIR-99021)预处理后,虫草素诱导胶质瘤细胞ROS过度产生的效果受到抑制,同时虫草素抑制GSH产生的效果得到逆转。抗氧化剂(NAC)能够逆转虫草素诱导的胶质瘤细胞ROS过度产生,生存率下降,细胞凋亡,MGMT,p-GSK-3β和β-catenin表达减少,减少替莫唑胺耐药的作用。5、在体内实验中,虫草素能够抑制肿瘤生长,降低MGMT,p-GSK-3β和β-catenin蛋白表达。相比于单独用药,联合应用虫草素和替莫唑胺能够明显延长荷瘤大鼠的中位生存期。结论:1、虫草素在体内和体外中均可抑制胶质瘤细胞活力,增强替莫唑胺的化疗敏感性。2、虫草素通过抑制胶质瘤细胞中MGMT的表达,从而增强替莫唑胺的化疗敏感性。3、虫草素可诱导胶质瘤细胞发生β-catenin依赖的MGMT抑制,从而增强替莫唑胺的化疗敏感性。4、虫草素通过线粒体中ROS的过度产生导致β-catenin依赖的MGMT抑制,从而增强替莫唑胺的化疗敏感性。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：
前言
中文摘要
Abstract
英文缩写词
第1章 绪论
第2章 文献综述
    2.1 胶质瘤
        2.1.1 胶质瘤简介
        2.1.2 胶质瘤的临床特点
        2.1.3 胶质瘤的分级和分子分型
        2.1.4 胶质瘤的治疗现状
    2.2 替莫唑胺和MGMT
        2.2.1 替莫唑胺简介
        2.2.2 替莫唑胺治疗胶质瘤的机制
        2.2.3 替莫唑胺耐药与MGMT
    2.3 Wnt/β-catenin信号通路
        2.3.1 Wnt/β-catenin信号通路概述
        2.3.2 Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤
    2.4 ROS
    2.5 虫草素
        2.5.1 虫草素概述
        2.5.2 虫草素在肿瘤治疗中的应用
第3章 实验材料与方法
    3.1 实验器材与试剂
        3.1.1 实验器材
        3.1.2 实验试剂
    3.2 细胞培养
    3.3 大鼠及裸鼠饲养
    3.4 实验试剂配制及储存
    3.5 实验技术
        3.5.1 MTT法检测肿瘤细胞存活率
        3.5.2 细胞克隆实验检测胶质瘤细胞增殖能力
        3.5.3 流式细胞术检测胶质瘤细胞的凋亡水平
        3.5.4 流式细胞术检测细胞周期
        3.5.5 细胞内ROS的测定
        3.5.6 DTNB-GSSG法检测细胞中GSH水平
        3.5.7 实时定量PCR
        3.5.8 细胞转染
        3.5.9 Western blot法检测细胞及组织内相关蛋白变化
        3.5.10 免疫组织化学染色法检测组织中相关蛋白水平
        3.5.11 大鼠颅内原位移植瘤模型实验和裸鼠皮下移植瘤模型实验
    3.6 统计学分析
第4章 实验结果
    4.1 虫草素抑制体外胶质瘤细胞活力
        4.1.1 虫草素以时间和浓度依赖的方式抑制胶质瘤细胞活力
        4.1.2 虫草素抑制胶质瘤细胞增殖
    4.2 虫草素诱导胶质瘤细胞凋亡和G2-M期周期阻滞
        4.2.1 虫草素诱导胶质瘤细胞凋亡
        4.2.2 虫草素诱导胶质瘤细胞G2-M期周期阻滞
    4.3 虫草素抑制胶质瘤细胞中MGMT表达并增强TMZ的化疗敏感性
        4.3.1 虫草素抑制胶质瘤细胞中MGMT表达
        4.3.2 虫草素增强TMZ在胶质瘤细胞中的化疗敏感性
    4.4 MGMT在虫草素减少胶质瘤细胞对TMZ耐药中发挥重要作用
    4.5 基因沉默β-catenin能够抑制MGMT表达并增强TMZ的化疗敏感性
    4.6 β-catenin在虫草素诱导的MGMT抑制及减少TMZ耐药中发挥重要作用
        4.6.1 虫草素抑制胶质瘤细胞中的Wnt/β-catenin通路
        4.6.2 CHIR-99021 逆转虫草素诱导的MGMT抑制和减少TMZ耐药
        4.6.3 过表达β-catenin逆转虫草素诱导的MGMT抑制和减少TMZ耐药
    4.7 β-catenin在虫草素诱导ROS过度产生中发挥重要作用
    4.8 ROS在虫草素诱导的β-catenin抑制、MGMT抑制及减少TMZ耐药中发挥重要作用
    4.9 虫草素抑制体内胶质瘤的生长并与TMZ具有协同作用
        4.9.1 虫草素抑制体内胶质瘤的生长
        4.9.2 在体内虫草素和TMZ联合应用具有协同抗胶质瘤作用
第5章 讨论
第6章 结论
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢

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本文编号：2857074