鸡油菌3-O-Me-Galactan活化巨噬细胞的作用研究

发布时间：2020-10-27 08:08

　　 鸡油菌是一种常用的食用菌,不仅营养丰富,而且具有食疗作用。多糖作为鸡油菌中的主要成分,具有抗氧化、抗肿瘤、促进脾细胞增殖以及免疫调节等功能。目前对鸡油菌多糖的活性研究较多,但对其活性的机制研究较少。本论文主要研究鸡油菌多糖活化巨噬细胞的作用机制,进而探讨其分子量与活化巨噬细胞的关系,以及通过调节巨噬细胞免疫抑制结肠癌细胞生长的作用机制,具体内容如下:利用水提醇沉法制备得到水溶性鸡油菌多糖WCCP。活性研究表明,WCCP能够活化巨噬细胞释放NO、TNF-α及IL-6。为了研究鸡油菌多糖中具有活化巨噬细胞作用的活性成分,进一步利用离子交换层析和凝胶层析对WCCP进行分级,得到中性糖均一级分WCCP-N-b和酸性糖均一级分WCCP-A-b,分子量分别为18 kDa和10 kDa。WCCP-N-b主要由Gal和Me-Gal组成,WCCP-A-b主要由Glc,Man和GlcA组成。实验室前期结构研究表明,WCCP-N-b的结构为线性的3-O-Me-Galactan,而WCCP-A-b是由β-1,6-D-Glcp构成主链,β-1,3-DGlcp、β-1,4-D-Manp及t-β-GlcpA构成侧链。对WCCP-N-b和WCCP-A-b活化巨噬细胞的作用进行分析,结果显示两个级分均能活化巨噬细胞,但WCCP-N-b的作用效果较好。因此,本论文选择对WCCP-N-b级分进行深入研究。WCCP-N-b能够促进巨噬细胞吞噬以及分泌NO和细胞因子的能力,从而活化巨噬细胞。通过WB、ELISA、免疫荧光和siRNA knockdown等方法对WCCPN-b活化巨噬细胞的机制进行研究。结果表明,WCCP-N-b通过巨噬细胞表面的TLR2受体,激活巨噬细胞内MAPK和NF-κB信号通路,使NF-κB入核,从而活化巨噬细胞,促进NO、TNF-α和IL-6的表达。WCCP-N-b不仅能够活化RAW264.7小鼠巨噬细胞系,还能够活化从Balb/c小鼠腹腔内分离的原代腹腔巨噬细胞和从Balb/c小鼠骨髓内分离出的原代骨髓单核巨噬细胞以及THP-1单核巨噬细胞,这说明WCCP-N-b能够活多种化巨噬细胞。为了进一步研究WCCP-N-b的分子量与调节巨噬细胞活性的关系,本论文采用部分酸水解的方法处理WCCP-N-b,制备得到四个分子量依次降低的级分,分别为WCCP-N-b1~4(16.1 kDa、11.2 kDa、5 kDa、3.5 kDa)。单糖组成结果显示,WCCP-N-b1~4的单糖组成基本不变,均与原始级分WCCP-N-b相同,说明部分酸水解仅改变了分子量大小,并未改变多糖的组成。对这几个级分活化巨噬细胞的能力进行分析发现,随着分子量降低,其促进巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-6的能力以及活化巨噬细胞内MAPK和NF-κB信号通路的能力逐渐减弱。当分子量达到3.5 kDa时,不再具有活化巨噬细胞的作用。上述结果说明,分子量是3-O-Me-Galactan活化巨噬细胞的一个关键因素。为研究WCCP-N-b活化巨噬细胞与抑制结肠癌细胞生长的关系,通过MTT、流式细胞仪检测以及WB等方法对WCCP-N-b抑制结肠癌细胞生长的作用进行分析。结果表明,WCCP-N-b活化RAW264.7细胞的上清能够抑制HCT116和HT29细胞增殖,促进HCT116和HT29细胞caspase依赖途径的凋亡。WCCPN-b活化的小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞上清能够抑制HCT116细胞增殖,当MAPK、NF-κB和TLR2受体被抑制后,其抑制HCT116细胞增殖的作用减弱。这一结果说明,WCCP-N-b可通过活化巨噬细胞,释放免疫活性物质来间接抑制结肠癌细胞生长。综上所述,本论文从鸡油菌多糖中获得线性3-O-Me-Galactan(WCCP-N-b),其通过巨噬细胞表面的TLR2受体,激活巨噬细胞内MAPK和NF-κB信号通路,活化巨噬细胞,分子量是影响其活性的关键。同时,该多糖可通过活化巨噬细胞间接抑制结肠癌细胞生长。这些研究结果丰富了多糖免疫调节及抗肿瘤研究的数据,为多糖的免疫调节活性与分子量的关系研究提供方法参考及理论依据,也为鸡油菌多糖作为功能性食品的开发提供理论支持。
【学位单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图 1-2 巨噬细胞的极化及其在疾病中的作用Fig. 1-2 Involvement of polarized macrophages in the pathophysiology of different human diseasesand the role of curcumin in polarization or re-polarization of macrophage.然而，机体对感染的初始感知和天然免疫的增强作用，主要是由模式识别受体（PRRs）介导的。研究报道表明，多糖能够与巨噬细胞表面的受体结合，激活细胞内信号通路，从而活化巨噬细胞。这些受体主要包括 Dectin-1、CR3、和 Toll 样受体等[56,60,61]。（2） 巨噬细胞表面的糖受体（a）Toll 样受体Toll 样受体是一种主要分布于免疫细胞表面的天然免疫受体，最早在果蝇中发现。随着人们对 Toll 样受体的深入研究，在哺乳动物体内发现有类似受体，因此

图 1-3 Toll 样受体在哺乳动物巨噬细胞内的活化机制Fig. 1-3 Activation of Toll like receptors in mammalian macrophagesTLR2 受体：TLR2 是 Toll 样受体家族成员之一，高表达于巨噬细胞、单DC 细胞等免疫细胞表面。通常情况下，TLR2 受体能够与 TLR1、TLR36 等受体形成异二聚体来发挥作用。在巨噬细胞中，TLR2 受体激活后，够通过 MyD88 依赖途径活化细胞内 MAPK 和 NF-κB 信号转导通路来促理活动，活化巨噬细胞。另一方面，TLR2 受体可以通过 MyD88 非依赖途 ERK 和 PI3K/AKT 信号转导通路来调节相关生理活动[63-67]。有报道表明碱提多糖能够通过 TLR2 受体，促进 RAW264.7 小鼠巨噬细胞系分泌 R 以及细胞因子，增强细胞吞噬能力，从而活化巨噬细胞[68]。闫晶敏等人从提取的水提多糖 WPEP-N-b 亦能够活化巨噬细胞。当用 TLR2 受体抑制胞后，WPEP-N-b 活化巨噬细胞的作用也被抑制，说明 WPEP-N-b 能够2 受体来活化巨噬细胞[69]。TLR2 受体不仅能够调节巨噬细胞的免疫功能

图 1-4 Dectin-1 受体结构模式图Fig. 1-4 Dectin-1 receptor structure mode diagram灵芝多糖能够与 Balb/c 小鼠腹腔巨噬细胞表面的 Dectin-1 受体结合，激活细胞内 MAPK 信号通路，促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌 IL-6 和 TNF-α，增强巨噬细胞的免疫反应[82,83]。有研究报道表明，Dectin-1 能够增强 TLRs 受体介导的免疫调节作用，而 TLRs 受体同时也可提高 Dectin-1 受体促进的 ROS 释放，二者可以协同作用，增强巨噬细胞的免疫反应[76,84]。（c）CR3补体受体 3（CR3）又称白细胞整合素，是巨噬细胞表面的重要膜受体之一。CR3 有两个功能结构域，iC3b 结合位点和凝集素结合位点，能够识别细胞粘附分子 ICAM-1，识别并固定 β-葡聚糖配体和 iC3b。β-葡聚糖能够与 CR3 的凝集素结合位点结合，从而活化巨噬细胞，而后与 iC3b 结合，使其特异性杀伤肿瘤细胞，
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本文编号：2858284