阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。认知功能障碍(Cognitive Dysfunction,CD)是逐渐向AD恶化的始端,CD的治疗对于防治AD具有重要意义。CD的病机发病机制较复杂,心藏神,肾藏精,神明聪慧,精养脑髓,心肾相交,神清脑明。心肾不交,心火旺盛,肾精虚衰,神扰髓消,聪慧不生。其中肾虚心火亢盛,心肾不交可能是发病机制之一。交泰丸作为治疗心肾不交的经典方剂,交通心肾,使心火清,肾精盈,神明内守,脑髓得养。交泰丸出自明代《韩氏医通》,是一首治疗失眠的名方,由黄连、肉桂两味药物组成,具有交通心肾,清火安神的功效。交泰丸中黄连具有保护神经元、改善神经炎症、缓解糖尿病引起的认知功能损伤的作用,肉桂则具有保护中枢神经系统、改善胆碱能系统的作用。目的:我们提出假设,认为交泰丸可能具有保护神经系统、改善认知功能障碍症状的作用,基于以上设想我们开展交泰丸对东莨菪碱模型小鼠认知功能障碍的作用及药效机制的研究。通过行为学实验观察交泰丸低、中、高剂量对小鼠学习、记忆能力的影响情况;通过研究交泰丸对脑组织胆碱能系统和氧化应激系统的相关指标,以及对神经元退行性病变情况和细胞凋亡情况的影响,探讨交泰丸在改善东莨菪碱模型小鼠认知功能障碍方面的作用机制。方法:将昆明小鼠96只雌雄各半,体重21-23g,随机分为6组。(1)利用Morris水迷宫、Y迷宫、新物体识别、条件恐惧实验观察小鼠学习记忆功能的改善情况。(2)采用分光光度法检测小鼠脑组织乙酰胆碱(Ach)水平、乙酰胆碱酯酶(AChE)及乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平、总超氧化物歧化酶(SOD)以及过氧化氢酶(CAT)活性。(3)利用免疫印迹(western blotting)法检测神经元BDNF,NGF,PSD95和SYN蛋白的表达情况以及凋亡蛋白Bcl-2,Bax,Caspase-3蛋白的表达情况。(4)采用尼氏染色和Tunel染色观察神经元的改变以及细胞凋亡情况。结果:交泰丸制剂中含有八种主要有效成分分别为木兰花碱(Magnoflorine)、格兰地新(Groenlandicine)、黄连碱(Coptisine)、药根碱(Jatrorrhizine)、非洲防己碱(Columbamine)、小檗碱(Berberine)、巴马汀(Palmatine)、桂皮醛(Cinnamaldehyde)。其中均含有黄连、肉桂的有效成分小檗碱、肉桂醛,并且小檗碱所占比例最高。逃避潜伏期实验中,模型组小鼠给予东莨菪碱药物后,小鼠学习记忆功能、空间记忆能力等认知功能均减弱,逃避潜伏期时间延长。阳性药组、交泰丸中、高剂量组逃避潜伏期均明显缩短,说明对于改善东莨菪碱模型小鼠的学习记忆功能有明显疗效。低剂量组改善学习、记忆功能方面有疗效,但并没有达到中、高剂量的效果。从空间探索试验观察小鼠的学习、空间记忆能力。模型组小鼠给予东莨菪碱药物后,小鼠学习、空间记忆能力等认知功能均减弱,穿越平台次数减少。阳性药组、交泰丸低、中、高剂量组穿越平台次数增加,说明对于改善东莨菪碱模型小鼠的学习、空间记忆能力有明显疗效。在空间探索试验观察小鼠记忆功能。模型组小鼠记忆、空间熟悉能力等认知功能均减弱,空间探索试验在平台象限停留时间减少。阳性药组、交泰丸低、中、高剂量组空间探索试验在平台象限停留时间增加,说明对于改善东莨菪碱模型小鼠的记忆功能具有疗效。Y迷宫实验中,东莨菪碱模型组小鼠的自发性交替反应百分数与空白对照组相比有统计学差异,P0.05,说明模型组小鼠的工作记忆功能低于空白对照组。安理申阳性药组自发性交替反应百分数与模型组相对比,虽具有改善趋势,但并不具有统计学差异P0.05,说明安理申多奈哌齐对于改善小鼠学习认知功能障碍有改善疗效但不明显。交泰丸低、中、高剂量组与模型组相比,自发性交替反应百分数有统计学差异P0.05,说明低、中、高剂量组对小鼠记忆认知功能有改善作用。由此可见,在改善小鼠记忆功能方面,交泰丸低、中、高剂量改善小鼠记忆功能方面具有疗效。新物体识别实验中,东莨菪碱模型组小鼠的对新事物识别指数与空白对照组相比具有下降趋势,但不具有统计学意义P0.05。安理申阳性药组新事物识别指数与模型组相对比没有显著性差异,但具有改善趋势P0.05,说明安理申多奈哌齐改善小鼠对于新鲜事物的熟悉能力有改善趋势,但并不明显。交泰丸低、中、高剂量组与模型组相比,没有显著性差异,但具有改善趋势P0.05,说明低、中、高剂量组改善小鼠对新鲜事物的熟悉能力具有改善作用。由此可见,交泰丸低、中、高剂量具有改善小鼠对新鲜事物识别记忆功能的能力。条件恐惧实验中,小鼠通过适应期后,观察测试东莨菪碱模型小鼠僵直次数与空白对照组相比有较显著统计学差异,P0.01,说明模型组小鼠对恐惧的记忆功能均明显低于空白对照组。安理申阳性药组与模型组的僵直次数相对比具有显著统计学差异,P0.01,说明安理申多奈哌齐改善小鼠对于恐惧的记忆功能具有改善趋势。交泰丸低、中、高剂量组与模型组相比,对于恐惧所产生的僵直次数有改变趋势,但无统计学意义P0.05,说明低、中、高剂量组改善对小鼠的恐惧记忆能力具有改善作用但不明显。由此可见,在改善小鼠记忆功能方面,交泰丸低、中、高剂量具有改善小鼠记忆功能的作用。模型组小鼠给予东莨菪碱造模后,小鼠Ach水平减弱。阳性药组、交泰丸低、中、高剂量组Ach水平升高,说明对于改善东莨菪碱模型小鼠的Ach水平有明显疗效。小鼠海马皮质AchE活性均升高。阳性药组、交泰丸低、中、高剂量组小鼠皮质海马AchE活性下降,说明交泰丸组对于抑制东莨菪碱模型小鼠的AchE活性具有疗效。小鼠ChAT活性减弱。阳性药组、交泰丸低、中、高剂量组ChAT活性增加,说明对于改善东莨菪碱模型小鼠的ChAT活性有明显疗效。小鼠海马皮质MDA水平均升高。阳性药组、交泰中、高剂量组小鼠皮质海马MDA水平下降,说明交泰丸组对于抑制东莨菪碱模型小鼠的MDA水平具有一定疗效。小鼠海马皮质活性氧(ROS)水平均升高。阳性药组、交泰丸组小鼠皮质海马活性氧(ROS)水平下降,说明交泰丸组对于抑制东莨菪碱模型小鼠的活性氧(ROS)水平有改善疗效。小鼠海马皮质SOD活力均下降。阳性药组、交泰低、中、高剂量组对改善小鼠皮质海马SOD活力均有升高,说明交泰丸组对于改善东莨菪碱模型小鼠的SOD活力具有治疗作用。小鼠海马皮质CAT活力均下降。阳性药组、交泰中、高剂量组对改善小鼠皮质海马CAT活力均有升高,说明交泰丸组在治疗东莨菪碱模型小鼠的CAT活力方面具有改善作用。交泰丸低、中、高剂量组的BDNF、NGF、SYN、Psd95蛋白的表达均有改善趋势,尼氏染色中东莨菪碱模型组小鼠的海马CA1区细胞呈现神经元明显萎缩,不规则排列,染色微弱,提示神经元受损扩散或死亡,在这些神经元中丢失了大量的尼氏体。交泰丸低剂量组小鼠海马CA1区细胞神经元部分显示饱满,排列较规则,染色正常,提示这部分神经元少部分恢复。交泰丸中、高剂量组小鼠海马CA1区细胞神经元显示较饱满,排列较规则,染色正常,提示这部分神经元部分恢复。交泰丸低、中、高剂量组对凋亡蛋白具有抑制作用,tunel染色阳性片呈深褐色,相比之下,东莨菪碱模型小鼠染色的切片,皮质内阳性细胞增多,背景深褐色加深。阳性药物多奈哌齐组并未发现细胞深褐色出现。交泰丸低、中剂量均发现少量阳性细胞,但高剂量组并未发现阳性细胞。东莨菪碱模型组相比空白对照组小鼠的相关行为学指标、胆碱能指标、氧化应激指标、神经元改善情况及凋亡蛋白情况均下降;阳性药多奈哌齐组小鼠胆碱能指标、氧化应激指标、神经元改善情况及凋亡蛋白情况相比模型组有所提高;交泰丸低、中、高剂量组与模型组相比较胆碱能指标、氧化应激指标、神经元改善情况及凋亡蛋白情况有所改善。结论:交泰丸能改善小鼠学习、记忆、空间辨识、新物体识别、条件恐惧等行为学能力;交泰丸能改善小鼠Ach、AChE、ChAT等胆碱能系统相关指标;交泰丸能改善小鼠MDA、ROS、SOD、CAT等氧化应激系统指标;交泰丸改善小鼠神经元BDNF,NGF,PSD95和SYN蛋白以及凋亡蛋白Bcl-2,Bax,Caspase-3蛋白的表达情况;交泰丸能改善小鼠海马CA1区神经元的形态、染色、排列情况;交泰丸对小鼠神经细胞的凋亡起到抑制和保护作用。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
论过图 1 结果可以看出，我们所熬制的交泰丸制剂中主要含有八种有效成花碱（Magnoflorine）、格兰地新（Groenlandicine）、黄连碱（Copti（Jatrorrhizine）、非洲防己碱（Columbamine）、小檗碱（Berberine）almatine）、桂皮醛（Cinnamaldehyde）。其中均含有黄连、肉桂的有效成
机制的研究25图 3 小鼠 5 天逃避潜伏期游泳轨迹图对比图3．结论：从表 1，图 2,3 中可以得出，东莨菪碱模型组小鼠的逃避潜伏期与空白对照组相比有显著统计学差异，P＜0.01，说明模型组小鼠的学习记忆、认知功能均明显低于空白对照组，造模成功。安理申阳性药组逃避潜伏期与模型组相对比，虽具有改善趋势，但并没有统计学意义，P＞0.05，说明安理申多奈哌齐对于改善小鼠认知功能障碍具有疗效但并不明显。交泰丸低剂量组与模型组相比，逃避潜伏期得到改善，但并不具有统计学差异 P＞0.05。交泰丸中、高剂量与模型组相比较，逃避潜伏期有明显改善，并有统计学差异，P＜0.05。在改善东莨菪碱模型小鼠空间学习记忆功能方面，交泰丸中、高剂量更有疗效。从以上结果可以看出，模型组小鼠给予东莨菪碱药物后，小鼠学习记忆功能、空间记忆能力等认知功能均减弱，逃避潜伏期时间延长。阳性药组、交泰丸中、高剂量组逃避潜伏期均明显缩短，说明对于改善东莨菪碱模型小鼠的学习记忆功能有明显疗效。低剂量组改善学习、记忆功能方面有疗效，但并没有达到中、高剂量的效果。（二）空间探索试验1．测定方法空间探索试验则在定位航行试验结束后 24h 进行，撤去平台，选择正南点将小鼠面朝池壁投入水中，让其自由在水中游行 60s
注：模型组与正常组相比较*P＜0.05，**P＜0.0#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。3．结论由表 14，图 16 可看出，东莨菪碱模型组白表达降低，并具有统计学差异 P＜0.01。阳对比，BDNF 蛋白的表达升高，并具有统计学差
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本文编号：
2861833
