莲心是睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)成熟种子的干燥幼叶及胚根,其主要活性成分为生物碱类,主要有甲基莲心碱、异莲心碱、莲心碱等。药理研究显示莲心具有抗氧化、抗炎、抗心律失常、抗癌、降低血糖等作用。本实验采用高效液相色谱法同时测定莲心提取物中甲基莲心碱、异莲心碱、莲心碱三种生物碱的含量,并对莲心提取物抗百草枯所致的小鼠肺纤维化作用及其机制进行研究。第一部分莲心提取物质量控制研究目的:建立高效液相色谱法测定莲心提取物中主要有效成分甲基莲心碱、异莲心碱、莲心碱含量的方法,为莲心提取物的质量控制提供依据。方法:Gemini-NX5U C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),乙腈-甲醇-水-三乙胺(40:20:40:0.12)作为流动相,流速1.0mL·min~(-1),检测波长282nm,柱温30℃。结果:甲基莲心碱在进样质量0.148~1.48μg(r=0.9995),异莲心碱在进样质量0.107~1.07μg(r=0.9995),莲心碱在进样质量0.067~0.67μg(r=0.9995)线性关系良好。方法稳定性、重复性好。甲基莲心碱平均回收率为101.1%,异莲心碱平均回收率为100.5%,莲心碱平均回收率为99.7%,RSD值分别为1.16%、1.53%、1.58%。结论:所建立的高效液相色谱法简单快速,稳定性高,重复性好,可以用于莲心提取物的质量控制。第二部分莲心提取物抗百草枯所致小鼠肺纤维化研究目的:研究莲心提取物对百草枯导致小鼠肺纤维化的作用,初步探讨其改善肺纤维化的可能机制。方法:1小鼠肺纤维化模型的建立:选取体重为18±2 g的雄性昆明小鼠,按随机数字法分为:正常对照组(NS)、百草枯模型组(PQ)、莲心提取物低剂量(LP-L)组、莲心提取物中剂量(LP-M)组,莲心提取物高剂量(LP-H)组、维生素C(Vc)组、地塞米松(DEX)组;除NS组外其余各组小鼠采用一次性腹腔注射百草枯(15mg kg~(-1))诱导小鼠肺纤维化模型。造模后24h各给药组灌胃给予对应药物,NS组灌胃给予同等量的生理盐水,DEX组给药3天,其余各组连续给药21天。2制备各组小鼠肺组织石蜡包埋切片,通过HE染色及Masson染色法,镜下判定各组小鼠肺部组织形态的变化。3应用免疫组织化学方法分析小鼠肺组织中I型胶原(Col-I)的表达情况。4采用ELISA法检测各组小鼠血清氧化指标丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量。5提取小鼠肺组织总RNA,通过RT-PCR分析各组小鼠肺组织中炎症因子白介素6(IL-6)、白介素17(IL-17)mRNA的改变情况。6采用ELISA法测定小鼠肺纤维化过程中产生的转化生长因子β1(TGF-β1)和羟脯氨酸(HYP)的含量。结果:1.在造模后第三周,NS组小鼠体重呈平稳上升趋势,PQ组小鼠体重增长缓慢,明显低于NS组(P0.01),而各给药组小鼠中,与PQ组相比,LP-L、LP-M、LP-H三组小鼠体重增长明显(P0.05,P0.01)。2.给药组小鼠肺组织颜色变暗,并且会出现灰白斑点,肺损伤程度较PQ组明显减轻。3.HE及Masson结果显示,给药组肺泡炎症及纤维化程度均出现明显减轻。从病理评分结果可见,PQ组肺泡炎症及纤维化评分比NS组高(P0.01),而LP-M,LP-H组炎症及纤维化评分明显低于PQ组(P0.05,P0.01)。4.PQ组小鼠肺组织Col-I染色面积比例明显高于NS组(P0.01),而各给药组小鼠肺组织Col-I染色面积比例都出现下降。5.与NS组比较PQ组小鼠血清中SOD水平显著降低(P0.01),而血清中MDA水平显著升高(P0.01)。给予不同剂量的LP后,与PQ组比较各组血清中SOD水平明显升高,MDA含量降低。6.与NS组比较,PQ组小鼠肺组织中IL-6、IL-17 mRNA表达量明显升高(P0.01)。与PQ组比较,各给药组小鼠肺组织中IL-6、IL-17 mRNA均出现不同程度降低。7.PQ组小鼠肺组织中TGF-β1和HYP的含量显著高于NS组(P0.01)。DEX组和LP-H组小鼠肺组织中的TGF-β1的含量均显著低于PQ模型组(P0.01)。LP-H组、LP-M和DEX组降低肺组织中HYP含量显著(P0.01,P0.05,P0.05)。结论:莲心提取物能够减轻小鼠肺纤维化的损伤,其机制可能为降低PQ所致小鼠肺纤维化的肺泡炎症反应,对肺纤维化过程中氧化应激反应进行调节,抑制小鼠肺组织中的TGF-β1重要信号因子的表达,抑制小鼠肺纤维化中后期的胶原沉积。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
图 1 混合对照品溶液和样品溶液 HPLC 图 1 The typical HPLC chromatograms of reference substances solutioand sample solution（B）1. Liensinine, 2. Isoliensinine, 3. Neferine
图 1 混合对照品溶液和样品溶液 HPLC 图 1 The typical HPLC chromatograms of reference substances solutiand sample solution（B）1. Liensinine, 2. Isoliensinine, 3. Neferine
异莲心碱标准曲线图
【参考文献】
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2861836
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