缺血性中风是因栓塞或者血栓引起的大脑中血管阻塞。缺血性中风发生后的炎症反应会加重继发的神经元损伤,不利于大脑功能的恢复。小胶质细胞是大脑中的常驻免疫效应细胞,在生理情况下持续监测大脑中的微环境。一旦局部缺血发生以后,小胶质细胞被迅速激活,激活后的小胶质细胞按照分泌因子和表面标记物的不同被定义为激活型小胶质细胞(M1型)和选择性激活型小胶质细胞(M2型),其中M1型小胶质细胞主要发挥促炎和神经毒性作用,M2型小胶质细胞主要发挥抗炎和神经保护作用。小胶质细胞参与脑缺血后炎症反应的发生、发展和转归,其表型转换与炎症反应密切相关。目前,清开灵注射液在缺血性中风后抗炎作用的潜在机制尚未被彻底阐明。本课题基于小胶质细胞表型变化探究清开灵注射液对脑缺血大鼠的抗炎作用机制,为研究中药制剂提供实验依据。目的(1)证明清开灵注射液对MCAO大鼠的脑保护作用及抗炎作用。(2)基于小胶质细胞表型变化探究清开灵注射液对MCAO大鼠的抗炎作用机制。方法(1)健康雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠,体重210-230g,随机分为三组,分别为:假手术组、模型组(0.9ml/100g)、清开灵组(0.9ml/100g)。模型组和清开灵组用线栓法制备大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,假手术组暴露并分离血管,但不插入线栓。清开灵组在MCAO同时腹腔注射用2倍生理盐水稀释后的清开灵注射液,缺血后4小时第二次给药。从第二天开始,每天给药2次,中间间隔12小时。假手术组和模型组腹腔注射等体积的生理盐水。在MCAO后24小时采用Bederson神经功能评分评定大鼠神经功能缺损情况,用TTC染色法测定大鼠脑梗死体积,用HE染色法观察大鼠大脑缺血灶周围组织病理形态变化。通过酶联免疫吸附法(Elisa)检测大鼠脑组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平,用Western blot法检测NF-κB通路p-p65/p65和p-IkBa的变化,观察缺血性中风后清开灵注射液对NF-κB信号通路的作用以及对促炎细胞因子的影响。(2)健康雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠,体重210-230g,随机分为三组,分别为:假手术组、模型组(0.9ml/100g)、清开灵组(0.9ml/100g)。模型组和清开灵组制备MCAO模型,假手术组暴露并分离血管,但不插入线栓。清开灵组在MCAO同时腹腔注射用2倍生理盐水稀释的清开灵注射液,缺血后4小时第二次给药,从第二天起每天给药2次,中间间隔12小时。假手术组和模型组腹腔注射等体积的生理盐水。在MCAO后24小时通过双重免疫荧光染色法观察M1型小胶质细胞标记物CD16和M2型小胶质细胞标记物CD206的表达。利用Q-PCR进一步检测M1型小胶质细胞特异性蛋白CD16、CD32、iNOS以及M2型小胶质细胞特异性蛋白CD206、TGF-β的mRNA的表达,通过观察小胶质细胞表型变化探究清开灵注射液对脑缺血大鼠的抗炎作用机制。结果(1)神经功能评分:假手术组大鼠无神经功能损伤,模型组和清开灵组大部分大鼠出现左侧偏瘫,身体向左侧打转,悬尾时左侧前肢不能完全伸直,内收并贴近胸壁。与假手术组相比,模型组大鼠神经功能评分显著升高(P0.01);给予清开灵注射液治疗后,与模型组相比,大鼠神经功能评分显著降低(P0.01),神经功能有一定程度的恢复。(2)TTC染色:假手术组大鼠脑组织呈现均匀的玫瑰红色;与假手术组相比,模型组大鼠脑组织呈现明显的白色缺血灶(P0.01);给予清开灵注射液治疗后,与模型组相比,清开灵组大鼠的脑梗死体积显著减小(P0.01)。(3)HE染色:假手术组大鼠脑组织结构完整,神经元细胞排列整齐有序,胞浆丰富,淡染,胞核大,核仁清晰。胶质细胞结构完整,排列整齐。模型组大鼠脑组织可见大片梗死灶,神经细胞大片消失,数量减少,排列紊乱,梗死灶周围胶质细胞明显增生,坏死边缘狭窄,中性粒细胞大量浸润。清开灵组大鼠脑梗死区面积显著减少,神经元数目减少程度低,轻度变性,胶质细胞增生不明显,边缘区增宽。(4)对NF-κB通路以及促炎因子的影响:大鼠大脑中动脉阻塞后,与假手术组相比,模型组促炎因子TNF-α(P0.01)、IL-1β(P0.01)、IL-6(P0.01)的表达明显升高;给药后,与模型组相比,清开灵注射液可以抑制三种促炎因子TNF-α(P0.01)、IL-1β(P0.05)、IL-6(P0.05)的表达,此外清开灵注射液降低了p-p65/p65的比值(P0.05),抑制了p-IkBa(P0.05)的表达。证明清开灵注射液能够抑制NF-κB通路的激活,抑制促炎因子的分泌,抗缺血后炎症。(5)双重免疫荧光染色及Q-PCR:双重免疫荧光染色结果显示清开灵注射液抑制MCAO后M1型小胶质细胞的标记物CD16(P0.01)的表达,升高M2型小胶质细胞标记物CD206(P0.01)的表达。Q-PCR结果显示清开灵注射液能够降低M1型小胶质细胞蛋白标记物CD16、CD32、iNOS的mRNA表达,升高M2型小胶质细胞蛋白标记物CD206、TGF-β的mRNA表达。结论(1)清开灵注射液可以减少MCAO大鼠脑梗死体积,降低大鼠神经功能评分,改善大鼠脑组织的病理损害,清开灵注射液能够抑制NF-κB通路的激活,减少促炎细胞因子的分泌,抑制缺血再灌注损伤大鼠的炎症反应,发挥脑保护作用。(2)清开灵注射液可以抑制M1型小胶质细胞标记物CD16的表达,促进M2型小胶质细胞标记物CD206的表达,降低M1型小胶质细胞特异性蛋白CD16、CD32、iNOS的mRNA的表达,上调M2型小胶质细胞特异性蛋白CD206、TGF-β的mRNA的表达,促进小胶质细胞向有益的表型M2型转换。清开灵注射液能够通过调控小胶质细胞表型发挥抗炎作用。其对小胶质细胞表型的调控可能与抑制NF-κB通路激活,降低促炎因子分泌有关。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
各组大鼠神经功能评分
经过TTC染色,脑梗死区呈现白色,正常组织被染成玫瑰红色。从图1-2可以看到模型组出现明显的梗死灶。实验结果表明,与空白组相比,模型组大鼠脑组织出现明显的缺血灶(P<0.01);与模型组相比,清开灵组能明显减少脑梗死体积(P<0.01)。结果见表2,图2和图3。图3 各组大鼠脑梗死体积(%)
各组大鼠脑梗死体积(%)
【参考文献】
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5 叶爱萍;王键;胡建鹏;;试论脑中风从调理气血论治[J];辽宁中医药大学学报;2015年02期
6 靳建宏;白冠锋;;补肾化痰逐瘀法治疗缺血性中风60例[J];中医研究;2014年09期
7 刘志军;杨瑞龙;杨涛;胡敏棣;窦友义;张谦;赵俊喜;;中风膏抗脑缺血再灌注损伤的实验研究[J];中国中医药科技;2014年03期
8 刘玥;张寅;张允岭;;化痰通腑法治疗缺血性中风急性期的Meta分析[J];中华中医药杂志;2014年05期
9 龚文胜;;血清TNF-α、IL-6在急性脑梗死病情及进展风险评估中的预测价值[J];中国实用医药;2014年02期
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3 田华;国医大师朱良春教授治疗缺血性中风病的学术思想及临证经验[D];南京中医药大学;2015年
4 张红;栀子苷衍生物的合成及抗炎免疫活性研究[D];安徽医科大学;2013年
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2863549
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