基于“线粒体自噬”探讨补青颗粒对高糖诱导人晶状体上皮细胞的影响及分子机制研究
发布时间：2020-10-31 12:30
目的观察补青颗粒调控“线粒体自噬”相关信号通路改善高糖诱导的SRA01/04细胞损伤及其分子机制,为补青颗粒治疗糖尿病性白内障的临床应用提供实验依据。方法1.按照血清药理学方法制备实验所需含药血清。将SD大鼠随机分为5组:空白对照组(10mL·kg-1蒸馏水)、阳性对照组(1 g·m L-1杞菊地黄丸水溶液)、补青颗粒高、中、低浓度组(4g·m L-1、2g·m L-1、1g·mL-1补青颗粒水溶液),每组15只,bid灌胃给药,连续给药7d,于末次给药1h后腹主动脉采血,3000rpm·min-1条件下高速离心制备含药血清。2.采用永生化人晶状体上皮细胞(SRA01/04)培养制备高糖模型。将SRA01/04细胞分成6组,根据本课题组前期研究成果,以30mmol·L-1葡萄糖浓度为最适细胞增殖浓度,用以模拟高糖环境分别干预各实验组,即10%空白血清组、高糖+10%空白血清组、高糖+10%杞菊地黄丸含药血清组、高糖+10%补青颗粒高、中、低浓度含药血清组(4、2、1 g·m L-1)。采用CCK-8法检测不同含药血清对高糖诱导的SRA01/04细胞24h增殖活力的影响。3.以各实验组含药血清干预高糖模型。分别采用免疫荧光技术观察各组细胞中线粒体自噬相关蛋白Parkin、Pink-1、P62的表达;采用Western bolt检测各组细胞中线粒体自噬相关蛋白Parkin、Pink-1、P62、Bnip3、Nix表达的变化;采用Real-time PCR法检测LC3-Ⅱ和LC3-ⅠmRNA的表达。结果1.CCK-8结果显示高糖诱导下SRA01/04细胞增殖活力异常升高,不同浓度补青颗粒含药血清对高糖诱导SRA01/04细胞增殖活力均有抑制作用,且以中浓度含药血清干预时,抑制作用显著(P0.05)。2.免疫荧光检测结果显示不同含药血清组SRA01/04细胞内均可见与线粒体自噬相关的蛋白Pink-1、Parkin、P62表达,且多于细胞质中表达,不同含药血清组上述蛋白表达量存在差异。3.Western bolt检测结果显示,在对Pink-1/Parkin信号通路研究中发现,高糖诱导下SRA01/04细胞可见线粒体自噬相关蛋白Pink-1、Parkin及P62的表达,给予补青颗粒含药血清干预后Pink-1、Parkin表达增高(P0.01),P62表达降低(P0.01);在对Bnip3/Nix信号通路研究中发现,高糖诱导下SRA01/04细胞可见Bnip3、Nix表达,且随损伤时间延长呈先增后减趋势,以损伤后24h达高峰,给予补青颗粒含药血清干预后,上述表达趋势更显著(P0.01),且作用时间延长(P0.01)。4.Real-time PCR检测结果显示不同含药血清组SRA01/04细胞内均可见微管相关蛋白LC3-Ⅱ与LC3-ⅠmRNA表达,且LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值呈先增后减趋势,并于损伤后24h时达高峰,给予补青颗粒含药血清干预后,上述趋势更明显(P0.01),且作用时间延长(P0.01)。结论补青颗粒能有效抑制高糖诱导下SRA01/04细胞的增殖,减轻因SRA01/04细胞过度增殖而导致的晶状体混浊,其机制可能与干预损伤后线粒体自噬相关蛋白的动态表达有关。
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
检测补青颗粒含药血清对高糖诱导人晶状体上皮细胞线粒n、P62 表达的影响下各组人晶状体上皮细胞中均可见 Pink-1、Parkin、P62 表胞核形成折光性较强的圆形或梭形表达，且大多位于细胞质所示，模型组 Pink-1、Parkin 表达较空白对照组增多，P62-1、Parkin 表达较模型组增多，P62 表达减少；而补青颗粒中菊地黄丸组增多，P62 表达减少（见图 2-4）。
量显著增高(P<0.01)。见表 3，图 6。表 3 各组细胞中 Parkin 蛋白表达（x s，n=10）Table3 protein expression levels of cyclin protein Parkin in each group（x s，n=10）组别 剂量/g·mL-1时间点/h Parkin空白组 - 24 0.729±0.106模型组 - - 1.044±0.1972)杞菊地黄丸组 1.0 - 1.353±0.1064)补青颗粒中浓度组 2.0 - 1.882±0.1764,6)空白组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01；与杞菊地黄丸P<0.01。
见表 4，图 7。表 4 各组细胞中 P62 蛋白表达（x s，n=10）Table 4 protein expression levels of cyclin protein P62 in each group（x s，n=10）组别 剂量/g·mL-1时间点/h P62空白组 - 24 0.638±0.137模型组 - - 0.434±0.0851)杞菊组 1.0 - 0.288±0.0134)补青颗粒中浓度组 2.0 - 0.211±0.0894,6)空白组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01；与杞菊地)P<0.01。
【参考文献】
本文编号：2863952
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
检测补青颗粒含药血清对高糖诱导人晶状体上皮细胞线粒n、P62 表达的影响下各组人晶状体上皮细胞中均可见 Pink-1、Parkin、P62 表胞核形成折光性较强的圆形或梭形表达，且大多位于细胞质所示，模型组 Pink-1、Parkin 表达较空白对照组增多，P62-1、Parkin 表达较模型组增多，P62 表达减少；而补青颗粒中菊地黄丸组增多，P62 表达减少（见图 2-4）。
量显著增高(P<0.01)。见表 3，图 6。表 3 各组细胞中 Parkin 蛋白表达（x s，n=10）Table3 protein expression levels of cyclin protein Parkin in each group（x s，n=10）组别 剂量/g·mL-1时间点/h Parkin空白组 - 24 0.729±0.106模型组 - - 1.044±0.1972)杞菊地黄丸组 1.0 - 1.353±0.1064)补青颗粒中浓度组 2.0 - 1.882±0.1764,6)空白组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01；与杞菊地黄丸P<0.01。
见表 4，图 7。表 4 各组细胞中 P62 蛋白表达（x s，n=10）Table 4 protein expression levels of cyclin protein P62 in each group（x s，n=10）组别 剂量/g·mL-1时间点/h P62空白组 - 24 0.638±0.137模型组 - - 0.434±0.0851)杞菊组 1.0 - 0.288±0.0134)补青颗粒中浓度组 2.0 - 0.211±0.0894,6)空白组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01；与杞菊地)P<0.01。
【参考文献】
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本文编号：2863952
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