雷公藤甲素对体内外足细胞的毒性作用和机制
发布时间：2020-10-31 15:10
目的:观察雷公藤甲素(TP)对体外正常永生化足细胞和动物体内正常足细胞的直接作用,探讨其中的机制及其临床意义。方法:体外实验采用人源永生化足细胞,不同剂量梯度(10 ng/ml、30 ng/ml、50ng/ml)雷公藤甲素处理足细胞,显微镜下观察细胞形态及死细胞数量的变化;采用Annexin V流式细胞分析检测细胞凋亡情况;采用western blot检测MAPK p38、P53、Bax、caspase3等分子的活化或表达水平的变化。同时不同剂量梯度地塞米松(1μmol、10μmol、100μmol)处理足细胞,qPCR检测,对比TP与地塞米松对部分足细胞共同表达的标志性基因,包括CD2AP、SYNPO、NPHS2、VEGFA、WT1和一些我们前期工作已验证的基因,如ENPEP、PAK1、FGFR1、GADD45A、CERS6、ZNF277、TSC22D1、SEPT10的转录水平的影响。同时用TP和地塞米松共同处理,检测上述情况,观察糖皮质激素是否可以逆转TP对足细胞的作用。体内实验TP(100~600μg/kg/day)腹腔注射小鼠28天,期间收集每周尿液,用银染检测蛋白尿情况;注射结束后取肾皮质采用电镜、PAS染色光镜、冰冻切片免疫荧光,检测肾小球以及足细胞的病理变化;取血,检测肾功能相关指标的改变情况;同时提取肾小球用qPCR检测足细胞重要基因的表达情况。提取大鼠肾小球体外培养,给予TP(30 ng/ml)处理24h,qPCR检测足细胞重要基因表达情况。结果:文献中常用的保护足细胞的TP浓度(10 ng/ml)就足以激活永生化足细胞中MAPK p38、p53、BAX等促凋亡信号,并能诱导细胞凋亡,而更高浓度的TP其损伤作用更明显,并且TP使得足细胞结构和功能所必需的基因表达显著下调。相反,糖皮质激素即使在高浓度的情况下对永生化足细胞无毒性作用。此外,TP诱导的足细胞凋亡、促凋亡信号激活、以及足细胞重要基因的下调均不能被糖皮质激素逆转。动物实验显示高剂量TP长期注射小鼠不能引起足细胞病理损伤,同时未出现足细胞必需基因的下调和蛋白尿的产生;最后,我们发现TP对离体培养的肾小球中的足细胞重要基因无下调作用,即对离体培养的肾小球中的足细胞无毒性作用。结论:TP对体外培养的永生化足细胞有毒性作用,但对体内足细胞和离体肾小球内的足细胞无毒性作用。我们的研究表明,(1)永生的足细胞可能在遗传上进化成对TP毒性敏感的细胞,因此在解读来自永生化足细胞的实验数据时应谨慎;(2)TP用于治疗各种疾病时不会对足细胞产生损伤;(3)由于TP诱导的足细胞损伤不能被激素逆转,TP可能成为激素抵抗型足细胞病分子机制研究的独特体外模型。
【学位单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
结果与分析.TP 导致体外培养的永生化足细胞损伤既往研究一般使用 10 ng/ml 用于足细胞损伤模型中的 TP 保护剂量[8-10]，为不同浓度的 TP 对培养的正常永生化足细胞的作用，我们分别采用三种浓度（g/ml、30 ng/ml、50 ng/ml）的 TP 处理足细胞，并分别处理 24h 和 48h，显微观察细胞形态、细胞死亡情况、贴壁细胞密度等。我们发现 TP 处理后足细态受损，漂浮的死亡细胞增多，并且随着 TP 的剂量越大，处理时间越长，胞死亡越多，贴壁细胞密度下降，并呈剂量和时间依赖性改变（图 1）。
P 处理细胞 24h 仅有凋亡增加的趋势，并无统计学差异，随后 48h 凋亡显著增统计学差异（图 2.B）。已有文献报道 MAPK p38 和 p53 均参与了足细胞的凋亡[14-17]，我们进行estern blot 检测，结果显示这三种不同浓度（10 ng/ml、30 ng/ml、50 ng/ml）P 均可激活足细胞中的 p38、p53 信号（图 3.A，B），并且呈剂量依赖性，这式细胞仪检测的结果相一致。此外，查阅文献可知 BAX 介导 p53 诱导的细亡，因此我们检测了 BAX 的蛋白水平表达情况，结果如预期所示，TP 可以 BAX 在足细胞中的蛋白表达水平（图 3C），与 p53 的激活相一致。同时检胞常见凋亡信号中的 caspase 3 发现，TP 未能激活足细胞中的 caspase 3 信号（），这表明 TP 诱导的足细胞凋亡可能通过独立于 caspase 3 之外的通路方式。
TP 未能激活足细胞中的 caspase 3 信号（图3D），这表明 TP 诱导的足细胞凋亡可能通过独立于 caspase 3 之外的通路方式进行。图 2：TP 诱导培养的永生化足细胞凋亡Annexin V-FITC/PI 染色和流式细胞术，A. 30 ng/ml 的 TP 处理足细胞的 Annexin V 流式代表性柱状图。B.10 ng/mlTP 也可以明显诱导培养的足细胞凋亡。NC（空白正常对照组）。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。所有数据均代表三个独立实验的结果。
【参考文献】
本文编号：2864115
【学位单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
结果与分析.TP 导致体外培养的永生化足细胞损伤既往研究一般使用 10 ng/ml 用于足细胞损伤模型中的 TP 保护剂量[8-10]，为不同浓度的 TP 对培养的正常永生化足细胞的作用，我们分别采用三种浓度（g/ml、30 ng/ml、50 ng/ml）的 TP 处理足细胞，并分别处理 24h 和 48h，显微观察细胞形态、细胞死亡情况、贴壁细胞密度等。我们发现 TP 处理后足细态受损，漂浮的死亡细胞增多，并且随着 TP 的剂量越大，处理时间越长，胞死亡越多，贴壁细胞密度下降，并呈剂量和时间依赖性改变（图 1）。
P 处理细胞 24h 仅有凋亡增加的趋势，并无统计学差异，随后 48h 凋亡显著增统计学差异（图 2.B）。已有文献报道 MAPK p38 和 p53 均参与了足细胞的凋亡[14-17]，我们进行estern blot 检测，结果显示这三种不同浓度（10 ng/ml、30 ng/ml、50 ng/ml）P 均可激活足细胞中的 p38、p53 信号（图 3.A，B），并且呈剂量依赖性，这式细胞仪检测的结果相一致。此外，查阅文献可知 BAX 介导 p53 诱导的细亡，因此我们检测了 BAX 的蛋白水平表达情况，结果如预期所示，TP 可以 BAX 在足细胞中的蛋白表达水平（图 3C），与 p53 的激活相一致。同时检胞常见凋亡信号中的 caspase 3 发现，TP 未能激活足细胞中的 caspase 3 信号（），这表明 TP 诱导的足细胞凋亡可能通过独立于 caspase 3 之外的通路方式。
TP 未能激活足细胞中的 caspase 3 信号（图3D），这表明 TP 诱导的足细胞凋亡可能通过独立于 caspase 3 之外的通路方式进行。图 2：TP 诱导培养的永生化足细胞凋亡Annexin V-FITC/PI 染色和流式细胞术，A. 30 ng/ml 的 TP 处理足细胞的 Annexin V 流式代表性柱状图。B.10 ng/mlTP 也可以明显诱导培养的足细胞凋亡。NC（空白正常对照组）。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。所有数据均代表三个独立实验的结果。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 傅强;江振洲;张陆勇;;Impairment of Triptolide on Liver Mitochondria in Isolated Liver Mitochondria and HL7702 Cell Line[J];Chinese Journal of Integrative Medicine;2013年09期
本文编号：2864115
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zhongyaolw/2864115.html
