乌梅丸调节肠道菌群对2型糖尿病的干预作用及机制研究

发布时间：2020-10-31 15:08

　　 目的:基于肠道菌群变化调节TLRs/NF-κB信号通路的机制,探讨乌梅丸对2型糖尿病模型大鼠血糖、胰岛素及炎性因子等的调控作用。方法:以60只健康清洁雄性SD大鼠为实验对象。按随机原则抽选10只作为正常组,其余50只给予高糖高脂乳剂饲养8周,小剂量腹腔注射STZ(35 mg/kg)建立T2DM模型,血糖大于11.10 mmol/L即为造模成功,将造模成功大鼠随机分为五组,即模型组、二甲双胍组(ig200 mg/kg)、乌梅丸高剂量组(ig20 g/kg)、乌梅丸中剂量组(ig10 g/kg)、乌梅丸低剂量组(ig5 g/kg),每组10只。用药四周后处理大鼠,股动脉取血离心备用,取粪便、结肠组织待检。定期监测各组大鼠体重及血糖值;提取大鼠粪便DNA采用16S-rDNA对其进行基因测序分析大鼠肠道微生物多样性;取大鼠结肠组织使用蛋白免疫印记法检测TLR-4和NF-κB p65蛋白表达水平;应用酶联免疫分析法(ELISA)检测大鼠血清胰岛素、LPS、TNF-α、IL-10的表达;取大鼠胰腺采用HE染色观察其形态学改变。结果:1.大鼠一般观察及体重监测:正常组大鼠精神活跃,活动正常,毛色洁白光亮,饮食饮水正常,体重呈稳态上升;高糖高脂乳剂饮食大鼠出现毛色发黄,体重增长明显高于正常组(P0.01);注射STZ后,大鼠多饮多食多尿症状明显,体重减轻(P0.01);用药四周后,乌梅丸组各剂量组及二甲双胍组大鼠多饮多食多尿症状逐渐缓解,体重下降趋势较模型组趋缓,体重明显高于模型组。2.血糖及胰岛素检测结果:造模前大鼠空腹血糖均属于正常范围,造模后大鼠血糖明显升高(P0.01);用药后二甲双胍组、乌梅丸各剂量组血糖均明显低于模型组(P0.05或P0.01)。用药四周检测血清胰岛素结果示:与正常组比较,模型组大鼠INS水平明显降低,乌梅丸各剂量组及二甲双胍组INS水平较模型组均升高(P0.01)。3.肠道菌群结构变化结果:3.1物种分析结果:正常组特有的OTU数目大于模型组,乌梅丸中、低剂量组与正常组OTU相似度高于模型组与正常组;模型组拟杆菌门数量较正常组增加,与模型组比较,乌梅丸高、中、低剂量组拟杆菌门数量均减少;与正常组比较,模型组厚壁菌门数量减少,与模型组比较,乌梅丸高、中剂量组厚壁菌门增加;模型组与正常组比较,模型组变形菌门丰度减少,与模型组比较,乌梅丸高、低剂量组变形菌门丰度增加,二甲双胍组、乌梅丸中剂量组变形菌门较模型组数量减少。模型组和乌梅丸高剂量组检测样品中未有TM7菌门出现,正常组、二甲双胍组、乌梅丸中、低剂量组均检测出TM7菌门。3.2 Alpha多样性(Alpha diversity)检测结果:sobs指数结果:正常组、乌梅丸低剂量组与二甲双胍组sobs指数明显高于模型组(P0.05),乌梅丸中剂量组sobs指数有升高趋势,但乌梅丸高剂量组明显减少。chao指数结果:模型组相比于正常组chao指数减少,与模型组比较,二甲双胍组与乌梅丸低剂量组明显增加(P0.01)。ace指数结果:模型组ace指数显著少于正常组(P0.05),二甲双胍组及乌梅丸中、低剂量组增加。shannon指数结果:各组组间无明显差异。4.结肠组织中TLR-4、NF-κB p65的蛋白检测结果:与正常组比较,模型组TLR-4、NF-κB p65蛋白表达量均明显上升,有显著性差异(P0.01);与模型组比较,乌梅丸高、中、低组及二甲双胍组TLR-4、NF-κB p65蛋白表达量均明显下降,有统计学意义(P0.01或P0.05)。5.血清中大鼠LPS、TNF-α、IL-10表达的ELISA检测结果:与正常组比较,模型组血清LPS、TNF-α水平明显上升(P0.01);与模型组比较,乌梅丸高、中、低各剂量组血清LPS、TNF-α水平表达量明显下降(P0.01)。与正常组比较,模型组血清IL-10水平明显减少(P0.01);与模型组比较,乌梅丸中剂量组血清IL-10水平表达量明显上升(P0.01),乌梅丸低剂量组、二甲双胍组IL-10水平增加(P0.05)。6.胰腺组织病理改变:正常大鼠的胰腺HE染色结果可见其中胰岛的数量丰富,形状有规则,胰岛细胞的界限清晰,2型糖尿病大鼠的胰岛数量减少,形状不规则,边缘不整齐等病理学改变;乌梅丸高、中剂量组和二甲双胍组改善明显。结论:乌梅丸各剂量组对2型糖尿病模型大鼠的行为、体重和空腹血糖、胰岛素水平均产生明显的恢复作用,并且可以改善胰腺病理损伤,乌梅丸可能是通过对肠道菌群多样性与物种丰度的调节作用,而起到降低模型鼠LPS水平,降低NF-κB p65及TLR-4蛋白表达,进而抑制炎性因子TNF-α,促进抗炎因子IL-10的生成,控制慢性低度性炎症的发生,从而达到防治2型糖尿病的目的。
【学位单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

11流程如图1。图1 测序总工作流程图Figure1 Sequencing total work flow chart2.7 结肠组织 NF-κB p65、TLR-4 蛋白表达检测2.7.1 结肠组织的提取：2型糖尿病模型大鼠灌胃乌梅丸四周后，禁食不禁水12 h，使用水合氯醛进行麻醉，大鼠生理反应消失后，在冰上操作，剪开大鼠腹部取结肠组织，结肠组织位于盲肠下部，在灭菌低温生理盐水中清洗结肠组织后，仔细分装，做好标记，放置于-80 ℃冰箱内保存备用。2.7.2 结肠组织蛋白的提取：称取结肠组织100 mg于EP管内，无菌操作尽量剪成细小碎片，全程在冰上操作，保持低温以防蛋白降解。按照蛋白提取量预估好组织裂解液的用量

图 6 乌梅丸不同剂量对 T2DM 大鼠体重的影响Figure6 Effects of Wumei Wan on body weight of T2DM rats3.1.2 各组大鼠空腹血糖及胰岛素变化

乌梅丸不同剂量对T2DM大鼠胰岛素的影响
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本文编号：2864113