柚皮素通过抑制小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活对LPS诱导的多巴胺能神经元损伤产生保护作用

发布时间：2020-10-31 14:44

　　 目的:研究柚皮素(NAR)对脂多糖(LPS)诱导的神经毒性的神经保护作用方法:在体实验中,SD大鼠随机分为5个组(n=6),包括空白组,NAR(100mg/kg)组,LPS(5μg)组,LPS+NAR(50 mg/kg)组和LPS+NAR(100 mg/kg)组。单侧中脑黑质注射LPS(5μg)诱导DA神经元损伤模型。造模后大鼠连续灌胃给药7天,转棒实验检测大鼠的运动能力,免疫荧光和Western Blot实验检测TH,IBA-1,NLRP3和caspase-1蛋白变化。离体实验中,BV-2小胶质细胞,随机分为5个组,空白组,NAR(100μM)组,LPS(1μg/ml)组,LPS+NAR(10μM)组,LPS+NAR(100μM)组。NAR预处理1 h后加入LPS诱导小胶质细胞的激活。24 h后,Griess试剂盒和ELISA试剂盒检测细胞上清中炎症因子(NO,IL-1β和IL-18)的释放,免疫荧光和Western Blot实验检测IBA-1、NLRP3和caspase-1蛋白变化。使用si RNA NLRP3转染技术,检测NLRP3蛋白的沉默率后,观察柚皮素对于LPS诱导的BV-2细胞激活的影响。BV-2和MN9D细胞共培养实验,将BV-2细胞和MN9D细胞均分为10个组,NAR预处理1 h后加入LPS诱导BV-2细胞的激活。24 h后,转移BV-2上清至MN9D细胞中,继续培养,24 h后,MTT方法检测MN9D细胞的活性,Western Blot实验检测MN9D细胞的TH蛋白变化。结果:在体实验结果显示:转棒实验中,模型组大鼠在棒时间比空白组减少,给予高剂量(100 mg/kg)柚皮素,大鼠在棒时间显著增加;免疫荧光和Western Blot结果显示,模型组DA神经元数量减少,小胶质细胞激活,NLRP3炎症小体表达增加,给予高剂量(100 mg/kg)柚皮素,DA神经元数量增加,小胶质细胞激活减少,NLRP3炎症小体表达减少。离体实验结果显示:与空白组比较,LPS可以引起BV-2细胞上清中炎症因子(NO、IL-1β和IL-18)的释放增加,IBA-1蛋白表达增加,NLRP3炎症小体表达增加,给予高剂量(100μM)柚皮素,上清中炎症因子释放减少,IBA-1蛋白表达减少,NLRP3炎症小体表达增加减少。并且si RNA NLRP3转染后,柚皮素对于BV-2细胞的调节作用消失。BV-2和MN9D细胞共培养实验结果显示:LPS刺激的BV-2细胞上清可以引起MN9D细胞的损伤,TH蛋白表达降低,给予高剂量(100μM)柚皮素,MN9D细胞的活性增加,TH蛋白表达增加。并且在si RNA NLRP3转染后,柚皮素对MN9D细胞的保护作用消失。结论:在本实验中,柚皮素可以通过抑制小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活,对LPS诱导的多巴胺能神经元损伤产生保护作用。
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图 1 柚皮素减轻 LPS 对 DA 神经元的损伤。A.大鼠转棒实验时间统计；B.大鼠中脑免疫荧光双标检测；C.大鼠中脑 DA 神经元数量；D.WesternBlot 检测大鼠中脑 TH 蛋白表达。（ x± SEM, n = 6），与空白组相比，*P < 0.05；与模型组相比，#P < 0.05。Fig.1 NAR attenuated LPS-induced DA neuronal loss in vivo. (A). The time rat stayed on the rodwas recorded. (B). DA neuronal counting by double-immunofluorescence staining with an anti-THantibody（blue）and anti-OX-42 antibody (red). (C). The number of SN TH-positive neurons wascounted and TH protein expression was detected by western blot assay (D). Data were expressed asa percentage of the control group and were the mean ±SEM from six rats. *P < 0.05 compared withcontrol group; #P < 0.05 compared with LPS group.2.2 柚皮素抑制小胶质细胞中 NLRP3 炎症小体的激活在 SD 大鼠实验中，进一步验证柚皮素对于 LPS 诱导的小胶质细胞激活及NLRP3 的影响。大鼠中脑免疫荧光双标结果显示：红色荧光代表小胶质细胞蛋白（OX-42），绿色荧光代表 NLRP3 蛋白，从光密度测定的结果可以看出：与空

BC图2 柚皮素抑制小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活。A.OX-42和NLRP3免疫荧光双标；B. OX-42 和 NLRP3 的光密度检测；C.Western Blot 检测大鼠中脑 IBA-1、NLRP3 和 caspase-050100150200250*#LPS - - + + +NAR (mg/kg)

与模型组比较，给予高剂量（100μM）柚皮素，NLRP3 和 caspase-1 蛋白表达降低（图4B）。A B图 4 柚皮素抑制 LPS 诱导的 NLRP3 炎症小体的激活。A.免疫荧光检测 NLRP3 蛋白；B.Western Blot 检测 NLRP3、caspase-1 蛋白表达。（ x±SEM,n=3）, 与空白组相比，*P<0.05；
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本文编号：2864086