基于蛋白质组学研究七味清肝散的抗肝纤维化作用及机制

发布时间：2020-10-31 23:39

　　目的:探讨七味清肝散的抗肝纤维化(HF)作用,并挖掘其潜在机制。方法:将雄性Wistar大鼠随机分为空白组、HF模型组和七味清肝散低、中、高剂量组[135、270、405 mg/(kg·d),以生药总量计],每组12只。除空白组外,其余各组均灌胃50%四氯化碳花生油溶液(2 mL/kg,每周2次,连续8周)以复制HF模型;与此同时,空白组和HF模型组大鼠均灌胃等容0.5%羧甲基纤维素钠溶液,各给药组大鼠均灌胃相应药物,每日1次,连续8周。观察各组大鼠的一般情况,于末次给药后观察其肝脏形态,并测定肝脏指数;检测大鼠血清肝功能指标[丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、羟脯氨酸(HYP)]含量以及肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况,并采用苏木精-伊红染色和Masson染色进行组织病理学观察。采用串联质谱标签(TMT)技术,以蛋白表达量的差异倍数为指标,筛选药物组(合并七味清肝散各剂量组肝组织样品)和HF模型组的差异表达蛋白,并借助Uniprot-GOA数据库以及KAAS、KEGG mapper在线工具等对其进行基因本体(GO)和KEGG通路富集分析。结果:空白组大鼠健康状况好;肝脏呈鲜红色且表面光滑,肝小叶完整,未见变性坏死、炎症细胞浸润或纤维组织增生。与空白组比较,HF模型组大鼠饮食减少、精神萎靡、皮毛杂乱且无光泽;肝脏呈暗红色或黄色,表面粗糙,质地较硬,可见炎症细胞浸润、纤维组织破坏、桥间连接等现象;其肝脏系数、肝功能指标含量和α-SMA的表达水平均显著升高(P0.05)。与HF模型组比较,七味清肝散各剂量组大鼠上述症状均有不同程度的改善,且低剂量组肝脏系数、高剂量组ALP含量以及各剂量组ALT、AST、HYP含量和α-SMA的表达水平均显著降低(P0.05)。共筛选出与HF有关的差异表达蛋白42个,其中表达上调15个、表达下调27个,包括脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)等。富集分析结果显示,差异表达蛋白主要富集于细胞外空间、血液微粒等细胞部位,涉及氧化还原酶活性、脂肪酸结合等分子功能,异型细胞间黏附的调控、蛋白质活化级联等生物过程以及视黄醇代谢、花生四烯酸代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)等信号通路。结论:七味清肝散可降低HF模型大鼠的肝脏系数以及血清中ALT、AST、ALP、HYP含量,下调α-SMA的表达,改善肝组织的炎症及纤维化程度,具有一定的肝保护作用。该方潜在抗HF作用机制可能涉及FABP4、CYP7A1、PPAR等多个靶点和信号通路。
【部分图文】：

富集,中心环节,相关研究,病理

图6 GO一级分类下的富集结果HSC激活是HF病理过程的中心环节，而α-SMA是HSC激活的标志物；HSC激活后，α-SMA呈高表达，会进一步造成ECM合成增多、堆积，最终引发HF[24]。本研究结果显示，与空白组比较，HF模型组大鼠肝组织中α-SMA的表达水平显著升高；与HF模型组比较，七味清肝散各剂量组大鼠肝组织中α-SMA的表达水平均显著降低。这提示该方可通过下调α-SMA的表达来抑制HSC的活化，从而发挥抑制HF的作用。上述结果与相关研究[11]基本一致。

病理,视黄醇,花生四烯酸,信号通路

KEGG通路富集结果显示，差异表达蛋白主要富集于类固醇激素的生物合成、视黄醇代谢、组氨酸代谢、花生四烯酸代谢、细胞色素P450代谢外源物质和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）等信号通路（P<0.05）。其中，视黄醇代谢、花生四烯酸代谢和PPAR信号通路与HF有关[13-14]，且PPAR信号通路中富集到了经七味清肝散作用后下调的脂肪酸结合蛋白4(FABP4）和胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1），二者亦与HF密切相关[15-17]。图2 各组大鼠肝组织Masson染色病理切片显微图（×100)

电泳图,病理,电泳图