目的随着人口老年化进程加快,神经退行性疾病的发病日趋严峻。研究认为,神经退行性疾病发生与发展与神经干细胞衰老密切相关,遗憾的是迄今还没有找到有效防止神经退行性疾病途径。中医临床的实践证明,可以通过“补益气血”途径有效延缓机体衰老。当归是中医临床“补血”要药,有“补益气血,延缓衰老,修复损伤”等作用。本研究通过构建D-半乳糖(D-gal)所致Nestin-GFP转基因小鼠脑衰老模型和神经干细胞(NSCs)体外衰老模型,探讨当归多糖(ASP)拮抗D-gal所致Nestin-GFP小鼠脑衰老作用及相关机制。方法1.雄性Nestin-GFP转基因小鼠60只,随机分为4组。脑衰老模型组:小鼠颈背部皮下注射D-gal(200mg/kg qd×42);ASP脑衰老模型组:在衰老模型组建立的基础上,从第16d起给与腹腔注射ASP(140mg/kg qd×27);ASP正常组:颈背部皮下注射生理盐水(等时、等量),第16d起腹腔注射ASP(剂量与时间同上);正常组:小鼠颈背部皮下注射等量生理盐水42d。各组给药完成第2d检测以下指标:(1)Morris水迷宫实验检测各组小鼠的空间学习与记忆能力;(2)取各组小鼠海马,制备冷冻切片,观察海马区NSCs荧光强度;(3)衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察各组海马组织中染色阳性细胞百分率;(4)酶标比色法检测海马区超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量以及Na+-K+-ATP酶活力;(5)ELISA检测各组海马区IL-1β,IL-6和TNF-a炎症因子变化;(6)Western Blot检测海马组织P53、P21含量变化。2.从Nestin-GFP转基因乳鼠脑中分离提取NSCs,原代培养至P3代。检测以下指标:(1)采用不同浓度的ASP(10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml,160μg/ml)分别作用P3代NSCs,培养24h、48h、72h后,采用CCK-8检测各组NSCs增殖能力。(2)取培养P3代的NSCs,随机分为四组。正常组:常规培养72h;ASP正常组:常规培养24h,加入ASP(100μg/ml)继续培养48h;衰老组:常规培养体系加入D-gal(20mg/ml)培养24h,致衰后继续常规培养48h;ASP衰老组:按衰老组方法培养细胞,24h后再加入ASP(100μg/ml)继续培养48h。衰老细胞模型建立后,检测以下指标:1)荧光显微镜观察Nestin免疫荧光鉴别NSCs;2)计数各组NSCs的SA-β-gal染色阳性神经球数目;3)酶标比色法检测各组SOD、T-AOC和MDA含量,流式细胞仪检测NSCs内ROS水平;4)ELISA检测各组IL-1β,IL-6和TNF-a炎症因子变化;5)Western Blot检测NSCs内P53、P21含量变化。结果1.体内结果1)Morris水迷宫实验结果显示,衰老组小鼠空间学习记忆能力明显降低,而ASP拮抗衰老组小鼠空间学习记忆能力明显改善;2)免疫荧光观察结果显示,衰老组小鼠海马DG区Nestin-GFP荧光强度明显度降低,而ASP拮抗衰老组小鼠海马DG区Nestin-GFP荧光强度明显增强;3)SA-β-Gal染色结果显示,衰老组小鼠海马组织中SA-β-Gal染色阳性细胞百分率明显增加,而ASP拮抗衰老组小鼠海马组织中SA-β-Gal染色阳性细胞百分率明显下降;4)酶标比色法检测显示,衰老组小鼠海马组织中SOD活性和T-AOC降低,MDA含量升高,Na+-K+-ATP酶活力降低;而ASP拮抗衰老组小鼠海马组织中SOD活性和T-AOC提高,MDA含量下降,Na+-K+-ATP酶活力增强;5)ELISA检测结果显示,衰老组小鼠海马组织中IL-1β,IL-6和TNF-a含量增多,而ASP拮抗衰老组小鼠海马组织中IL-1β,IL-6和TNF-a含量明显下降;6)Western Blot检测显示,衰老组小鼠海马组织P53、P21含量升高,ASP拮抗衰老组小鼠海马组织P53、P21含量降低。2.体外结果1)荧光显微镜观察Nestin免疫荧光鉴别NSCs,体外培养的神经球呈现Nestin绿色荧光阳性反应;2)ASP体外作用NSCs可提高起NSCs增殖能力,并且NSCs增殖能力与ASP浓度成正相关;3)SA-β-Gal染色结果显示,衰老模型组NSCs的SA-β-gal染色阳性神经球数目增多,而APS拮抗衰老组NSCs的SA-β-gal染色阳性神经球数目降低;4)酶标比色法检测结果显示,衰老组NSCs培养上清液中SOD活性和T-AOC降低,MDA含量升高,流式细胞仪检测NSCs内ROS水平提高;而APS拮抗衰老组SOD活性和T-AOC提高,MDA含量降低,NSCs内ROS水平降低;5)ELISA检测结果显示,衰老组NSCs培养上清液中IL-1β,IL-6和TNF-a含量增多,而APS拮抗衰老组NSCs培养上清液中IL-1β,IL-6和TNF-a含量下降;6)Western Blot检测结果显示,衰老组NSCs衰老相关P53、P21蛋白含量增加,而APS拮抗衰老组NSCs衰老相关P53、P21蛋白含量降低。结论1、本研究采用D-gal复制的模型确为脑衰老模型2、ASP能拮抗D-Gal所致小鼠脑衰老,其机制可能与抑制氧化应激损伤、下调炎症因子水平及衰老相关基因、维持海马区神经干细胞数量有关。3、ASP能在体外拮抗D-gal诱导的NSCs衰老,其机制可能与ASP调节NSCs氧化与抗氧化能力,调控衰老相关基因有关。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
图 1.1 ASP 对脑衰老小鼠定位航行实验逃避潜伏期的影响 (x±s，n = 15)Fig1.1 Effects of ASP on the escape latency in spatial orientation test of bra( ±s，n = 15)图 1.2 ASP 对脑衰老小鼠空间探索实验的影响( ±s，n = 15)Fig1.2 Effect of ASP on space exploration test of brain aging mice( ±s，n =脑衰老模型组与正常组相比(Comparison between D-gal group and norma
18图 1.2 ASP 对脑衰老小鼠空间探索实验的影响( ±s，n = 15)Fig1.2 Effect of ASP on space exploration test of brain aging mice( ±s，n = 15)脑衰老模型组与正常组相比(Comparison between D-gal group and normal group)，#P<0.05；ASP 脑衰老模型组与脑衰老模型组相比(Comparison between ASP+D-gal group andD-gal group)，*P<0.052.2 ASP 能降低脑衰老小鼠海马 CA3 区 SA-β-Gal 染色阳性强度
图 1.3ASP 对脑衰老小鼠海马 CA3 区细胞衰老的影响 (SA-β-Gal 染色，×100)Fig1. 3 Effects of ASP on aging stain in area CA3 in hippocampus of brain-aged mice(SA-β-Gal staining, ×100)A.正常组(Normal group)；B. ASP 正常组(ASP normal group)； C. ASP 脑衰老模型组(ASP+D-gal group)；D. 脑衰老模型组(D-gal group)
【参考文献】
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本文编号：
2865977
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