中药蛇六谷基原鉴定及抗肿瘤活性研究

发布时间：2020-11-02 02:41

　　 目的:针对临床应用蛇六谷药材基原混乱的问题,研究建立蛇六谷药材传统鉴定方法及分子标记DNA条形码鉴定方法,明确该药材基原,为临床合理安全用药提供科学依据;同时进行蛇六谷抗肿瘤活性部位及敏感肿瘤细胞的筛选,为蛇六谷抗肿瘤活性成分的物质基础研究提供理论依据,为蛇六谷抗肿瘤的深入开发研究奠定基础。方法:采用文献综述方法,查阅历代本草对蛇六谷记载,进行基原考证,并收集各地收录蛇六谷药材标准及炮制规范,通过实地调研,收集各种样品共21份;采用原植物性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别、含量测定及建立特异性引物聚合酶链式反应DNA条形码分子鉴定技术等对蛇六谷的基原进行确定,并全面提升其质量标准,增强质量可控性;采用CCK-8法对系统溶剂法制备的蛇六谷不同极性部位活性进行筛选,以及对体外培养的人肝癌HepG-2细胞、人胃癌GTL-16细胞、人卵巢癌SK-OV-3细胞和人乳腺癌MCF-7细胞进行蛇六谷体外抗肿瘤活性研究,并通过荧光倒置显微镜观察细胞形态学的变化及流式细胞仪检测细胞凋亡进一步研究蛇六谷活性部位抑制肿瘤增值的活性。结果:1.对收集得到的21份蛇六谷样品通过文献描述和进行传统方法鉴定,找出了种间性状差异,确定蛇六谷药用植物基原为天南星科魔芋属的魔芋和疏毛魔芋两种,经过显微鉴别、薄层鉴别、含量测定研究证明样品编号1、3、4、6、8、9、11、12、13、14、15、N、X、Y、G、S、J为蛇六谷正品魔芋和疏毛魔芋,样品编号2、5、7为蛇六谷伪品,样品编号10性状与蛇六谷性状相似,但是无薄层行为,未鉴定出;通过DNA条形码分子鉴定技术,对蛇六谷药用基原植物疏毛魔芋设计出特异性PCR引物,建立的DNA条形码分子鉴定方法可快速检测出蛇六谷药用植物疏毛魔芋。2.体外抗肿瘤活性研究表明,蛇六谷对人肝癌HepG-2细胞、人胃癌GTL-16细胞、人卵巢癌SK-OV-3细胞、人乳腺癌MCF-7细胞均具有良好的抑制增殖作用,且呈现出较好的剂量-时间效应关系;通过比较不同极性部位对体外培养的上述四种肿瘤细胞抑制率和IC50值,表明乙酸乙酯部位具有较高的抑制肿瘤细胞增殖的活性,且其对人卵巢癌SK-OV-3细胞的IC50值最低,为0.766mg/ml,表明蛇六谷抗肿瘤活性主要集中在乙酸乙酯部位;在用不同浓度乙酸乙酯提取物作用于上述四种细胞24h后,置荧光倒置显微镜观察细胞形态可见大部分细胞形态异常,体积缩小,失去原固有形态,并且稀疏散在,密度均明显减小、细胞贴壁能力减弱,存活数呈下降趋势;细胞壁皱缩、胞浆浓缩、透光率下降,细胞由正常的集落生长变得间距变大、间连接减少,产生凋亡小体,证明蛇六谷乙酸乙酯萃取物可诱导肿瘤细胞凋亡;流式细胞仪检测证明细胞凋亡率随着乙酸乙酯提取物给药浓度和时间的推移显著增加,表明乙酸乙酯部位具有较好的抑制肿瘤细胞增殖的活性。结论:1.以传统鉴别方法结合DNA条形码分子鉴定技术,确定蛇六谷药用植物基原,全面提升药材的质量评价标准,建立能快速较好区分蛇六谷正品及伪品的方法。2.以CCK-8法对蛇六谷体外抗肿瘤活性及活性部位筛选,通过计算蛇六谷不同极性部位对四种肿瘤细胞的抑制率及IC50值得出,蛇六谷乙酸乙酯部位表现出较好的活性,其抑制率高于蛇六谷其他极性部位,并且对人卵巢癌SK-OV-3细胞的IC50值最低;细胞形态学观察和流式细胞仪检测表明蛇六谷乙酸乙酯萃取物具有良好的抑制肿瘤细胞增殖的活性,为进一步研究蛇六谷抗肿瘤活性成分及抗肿瘤作用机制奠定基础。
【学位单位】：山西省中医药研究院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R282.5;R285
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第一章 蛇六谷基原鉴定
    第一节 原植物性状鉴别
        1 材料
        2 方法
        3 结果
        4 小结
    第二节 药材性状鉴别
        1 材料
        2 方法
        3 结果
        4 小结
    第三节 显微鉴别
        1 材料
        2 方法
        3 结果
        4 小结
    第四节 薄层鉴别
        1 材料
        2 方法
        3 结果
        4 小结
    第五节 多糖含量测定
        1 材料
        2 方法
        3 结果
        4 小结
    第六节DNA分子ITS/ITS2鉴别
        1 材料
        2 方法与步骤
        3 结果与分析
        4 小结
    第七节 采用特异性引物PCR方法检测基原
        1 材料
        2 方法
        3 结果
        4 小结
第二章蛇六谷抗肿瘤活性部位筛选及对不同肿瘤细胞活性研究
    第一节 蛇六谷不同极性提取物制备
        1 材料
        2 方法
        3 结果
    第二节 蛇六谷不同部位对不同肿瘤细胞抑制增殖作用初步筛选
        1 材料
        2 方法与步骤
        3 结果与分析
        4 小结
    第三节 蛇六谷乙酸乙酯萃取物对肿瘤细胞抑制增殖作用研究
        1 材料
        2 方法
        3 结果与分析
        4 小结
结语
    1 结论
    2 创新点
    3 不足与展望
参考文献
综述
    参考文献
附录 缩略语说明
攻读学位期间发表文章情况
致谢

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本文编号：2866455