益肾活血方颗粒抗大鼠早期糖尿病肾病作用及机制的研究

发布时间：2020-11-02 05:08

　　 益肾活血方颗粒是由人参皂苷、黄芪、五味子等六味中药组方而成的中医临床经验方颗粒剂。临床实践发现,益肾活血方颗粒具有稳定早期糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)患者血糖水平和改善肾脏功能的治疗作用,但缺乏治疗效果的有效证据和作用机制的系统研究。而且中药复方制剂存在化学成分复杂、药效物质和体内代谢过程不明确、质量标准难以控制等问题。因此,探究益肾活血方颗粒对早期DN的治疗作用及机制、简化复方成分得到化学结构明确且疗效确切的有效成分,不但可增加益肾活血方颗粒在临床上的应用,降低不良反应的发生率,而且可扩大中药产品在国际市场的应用,实现中药现代化开发,同时为抗DN新药的研发提供新思路。基于网络药理学和现代中药药理研究,我们以君药(人参皂苷和黄芪)的化学单体成分为研究对象,通过对文献进行深度文本挖掘,着眼于抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导,遴选并最终确定人参皂苷Rg1(Rg1)和黄芪甲苷(AS-IV)为益肾活血方颗粒的主要药效成分。本论文旨在探究益肾活血方颗粒及其主要药效成分Rg1联合AS-IV,对链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导的早期DN大鼠的作用及机制。具体研究如下:一、益肾活血方颗粒对大鼠早期DN影响的研究研究方法:构建STZ诱导的早期DN大鼠模型并随机分组给药:STZ组[10ml/kg/d生理盐水,灌胃(ig)]、贝那普利组(1mg/kg/d贝那普利,ig)、益肾活血方颗粒低剂量组(0.5g/kg/d益肾活血方颗粒,ig)、中剂量组(1.0g/kg/d益肾活血方颗粒,ig)和高剂量组(2.0g/kg/d益肾活血方颗粒,ig),另取未造模大鼠为对照组(10ml/kg/d生理盐水,ig)。每天给药1次,连续给药8周后,收集大鼠24h尿液样本、血液样本、肾脏组织样本。检测尿液中β2-MG、mALB和UCr水平;检测血清中BUN、UREA、SCr、NOS、CAT、GSH-PX、MDA和T-AOC水平;左侧肾脏进行HE和PAS病理分析,以及TGF-β1、Smad2/3和Smad7的免疫组化检测;右侧肾脏进行TGF-β1、Smad2/3、Smad7和CTGF的western blot检测。研究结果:与STZ组比较,益肾活血方颗粒中、高剂量组:1)显著降低肾脏肥大指数(p0.01)、24hUV(p0.001)、β2-MG(p0.001)、mALB(p0.001)、UAER(p0.001)、UCr(p0.001)、SCr(p0.001)、UREA(p0.001)和BUN(p0.001)水平,增加BW(p0.001)和CCr(p0.05)水平,有效改善大鼠肾脏功能;2)抑制肾小球肿胀,保护系膜结构,降低病变肾小球比率,改善大鼠肾脏病理;3)显著增加NOS(p0.05)、CAT(p0.001)、GSH-PX(p0.001)和T-AOC(p0.001)水平,降低MDA(p0.001)水平,有效降低大鼠氧化应激水平;4)明显降低大鼠肾脏组织因STZ诱导引起的TGF-β1、Smad2/3和CTGF过表达,增加Smad7的表达水平,有效抑制TGF-β1/Smads信号通路传导;5)确定1.0g/kg为DN大鼠的最佳治疗剂量。二、益肾活血方颗粒主要有效成分的筛选与测定研究方法:在对文献进行深度文本挖掘基础上,遴选Rg1和AS-IV为益肾活血方颗粒的主要药效成分。建立Rg1和AS-IV的LC-MS检测方法,并进行方法学考察。测定益肾活血方颗粒中Rg1和AS-IV的含量。取大鼠随机分组给药:中剂量组(1.0g/kg益肾活血方颗粒,ig)、Rg1组(中剂量组中Rg1的等剂量,ig)、AS-IV组(中剂量组中AS-IV的等剂量,ig)和Rg1+AS-IV组(中剂量组中Rg1+AS-IV的等剂量,ig)。分别于给药后0h、5min、15min、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h和24h检测各组大鼠血液中Rg1和AS-IV的浓度,分析药时曲线。研究结果:1)自建LC-MS法对Rg1和AS-IV检测的方法学参数良好。2)益肾活血方颗粒中Rg1含量为50mg/g,AS-IV含量为16mg/g,以此为Rg1联合AS-IV的用药浓度。3)与Rg1组相比,Rg1+AS-IV组和中剂量组在给药后15min~24h血浆Rg1浓度(p0.05)、AUC_(0-)∞(p0.05)、Cmax(p0.05)、C_(24h)(p0.01)显著升高;而Rg1+AS-IV组与中剂量组比较无显著性差异。4)与AS-IV组比较,Rg1+AS-IV组和中剂量组在给药后15min~6h血浆AS-IV浓度(p0.01)、AUC_(0-∞)(p0.05)和Cmax(p0.05)显著升高;Rg1+AS-IV组与中剂量组比较无明显差异。三、Rg1+AS-IV抗大鼠早期DN的作用及机制研究方法:构建STZ诱导的早期DN大鼠模型并随机分组给药:STZ组(10ml/kg/d生理盐水,ig)、中剂量组(1.0g/kg/d益肾活血方颗粒,ig)、Rg1组(50mg/kg/d Rg1,ig)、AS-IV组(16mg/kg/d AS-IV,ig)和Rg1+AS-IV组(50mg/kg/d Rg1+16mg/kg/d AS-IV,ig),另取未造模大鼠为对照组(10ml/kg/d生理盐水,ig)。每天给药1次,连续给药8周后,收集大鼠24h尿液样本、血液样本、肾脏组织样本。检测尿液中β2-MG和UCr水平;检测血清中BUN、SCr、CAT、GSH-PX、MDA和T-AOC水平;左侧肾脏进行HE病理分析,以及TGF-β1、Smad2/3、Smad7和CTGF的免疫组化检测;右侧肾脏进行TGF-β1、Smad7和CTGF mRNA的Real-Time PCR检测。研究结果:与STZ组比较,Rg1组、AS-IV组和Rg1+AS-IV组均可以:1)增加大鼠BW(p0.05)和CCr(p0.05)水平,降低24hUV(p0.05)、β2-MG(p0.05)、UCr(p0.05)、SCr(p0.05)和BUN(p0.05)水平,提高早期DN大鼠肾脏功能;2)维持肾小球体积正常,保护肾小球系膜和基底膜结构,降低病变肾小球比率,改善早期DN大鼠肾脏病理;3)增加CAT(p0.05)、GSH-PX(p0.05)和T-AOC(p0.05)水平,降低MDA(p0.05)水平,增加机体抗氧化应激水平;4)显著降低大鼠肾脏TGF-β1(p0.05)、Smad2/3(p0.05)和CTGF(p0.05)的表达水平,增加Smad7(p0.05)的表达水平。明显降低TGF-β1和CTGF的转录,升高Smad7(p0.05)的转录,有效抑制早期DN大鼠肾脏TGF-β1/Smads信号通路传导。由Rg1组、AS-IV组和Rg1+AS-IV组比较可知:1)Rg1组对改善早期DN大鼠肾脏功能和抗氧化应激作用优于AS-IV组;2)AS-IV组对TGF-β1/Smads信号通路传导的抑制作用优于Rg1组;3)Rg1+AS-IV组对早期DN大鼠的肾脏保护、抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导作用,优于Rg1组和AS-IV组。由Rg1+AS-IV组与中剂量组比较可知:Rg1+AS-IV组与中剂量组对早期DN大鼠的肾脏保护作用、增强抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导作用无显著差异;Rg1+AS-IV组对早期DN大鼠肾脏Smad7和CTGF转录水平的影响弱于中剂量组,但Rg1+AS-IV组与中剂量组在Smad7和CTGF翻译水平的影响无明显差异。以上研究结果表明:益肾活血方颗粒对STZ诱导的早期DN大鼠有良好的治疗作用,其肾脏保护作用与抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导有关。基于这两方面的作用机制,通过文本挖掘和LC-MS方法检测,确定益肾活血方颗粒中人参皂苷Rg1(50mg/g)联合AS-IV(16mg/g)对STZ诱导的早期DN大鼠的肾脏保护作用、增强抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导作用与益肾活血方颗粒相当,为探寻益肾活血方颗粒有效组分的深入研究提供重要依据。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图2 TGF-β/Smads信号通路传导示意图，引自Cell Signaling TechnologyTGF-β1 在机体内主要以无活性形式，当机体 AGEs 水平升高、ROS 增多或pH 改变等可使 TGF-β1 在细胞外活化[115]。Smads 家族是目前已知唯一的 TGF-β受体的细胞内激酶底物，将 TGF-β 信号传导至细胞核内。这一过程如下：AGE等因素诱导 TGF-β1 在细胞外活化，活化后 TGF-β1 与细胞膜表面 TβRⅡ结合并促进TβRⅠ激酶磷酸化，然后使细胞质内信号分子Smad2和Smad3磷酸化激活，被激活的 Smad2、Smad3 会与 Smad4 形成复合物，此复合物可以转位至细胞核调控相关细胞因子如转录激活因子(AP-1)、结缔组织生长因子(CTGF)等的表达；Smad4 是此信号通路中重要的中间复合体蛋白，而 Smad6 和 Smad7 是信号通路的负调控蛋白，通过与 TβRⅠ作用阻断 Smad2 和 Smad3 的磷酸化激活，从而抑制细胞内信号通路的传导[116-120]。CTGF 是引起肾脏功能损伤的一个重要调节因子，研究发现 CTGF 水平升高可加剧 DN 的发展进程，CTGF 不但可以促进肾小球基底膜增厚，而且还具有促进肾间质纤维化的作用[121,122]。CTGF 既是 TGF-β1

28图 3 益肾活血方颗粒对早期 DN 大鼠 BW 的影响注：A：不同时间段各组大鼠体重的比较；B：各组大鼠体重随给药时间的变化。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs.对照组；#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs.STZ 组；&p<0.05, &&p<0.01, &&&p<0.001 vs.贝那普利组。

29图 4 益肾活血方颗粒对早期 DN 大鼠血糖的影响注：A：不同时间段各组大鼠血糖的比较；B：各组大鼠血糖随给药时间的变化。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs.对照组；#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs.STZ 组；&p<0.05 vs.贝那普利组。
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本文编号：2866611