淫羊藿总黄酮调控miR-34a-5p保护成骨细胞脂多糖诱导性损伤的作用机制

发布时间：2020-11-03 00:53

　　 目的探讨淫羊藿总黄酮(total flavones of epimedium,TFE)调控miR-34a-5p保护脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的成骨细胞损伤的作用机制。方法建立LPS诱导的大鼠成骨细胞模型,给予TFE含药血清,MTT法检测成骨细胞活性。构建荧光素酶报告基因,检测荧光活性,脂质体瞬时转染miR-34a-5p模拟物和抑制剂。RT-PCR分析转染前后miR-34a-5p、SMAD2、ALP、RUNX2mRNA的表达,Western blot检测SMAD2、RUNX2、ALP蛋白表达。结果 TFE能提高LPS诱导的成骨细胞活性,促进RUNX2、ALP蛋白表达(P0.01)。TFE在LPS诱导的成骨细胞中可促进miR-34a-5p的表达,抑制SMAD2的mRNA及蛋白表达水平。miR-34a-5p转染细胞后,显著降低荧光素酶报告基因的活性,促进成骨细胞RUNX2、ALP的蛋白表达。抑制miR-34a-5p可促进成骨细胞SMAD2mRNA及蛋白表达,并抑制成骨因子的表达(P0.05),逆转了TFE对LPS诱导的成骨细胞损伤的保护作用。结论 TFE通过调控miR-34a-5p与SMAD2相互作用,减轻LPS诱导的成骨细胞损伤。
【文章目录】：
1 材料
    1.1 实验动物
    1.2 药物与试剂
    1.3 主要仪器
2 方法
    2.1 TFE及含药血清制备
    2.2 原代成骨细胞的制备及分组
    2.3 MTT法测定细胞活性
    2.4 成骨细胞碱性磷酸酶合成及钙沉积的测定
    2.5 ELISA法检测炎性因子表达的影响
    2.6 荧光素酶报告质粒的构建和荧光素酶活性分析
    2.7 细胞转染
    2.8 RT-PCR检测成骨细胞各组转染前后RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA表达水平
    2.9 Western blot检测成骨细胞各组转染前后SMAD2、ALP、RUNX2蛋白的表达
    2. 10 统计学处理
3 结果
    3.1 MTT检测成骨细胞增殖率的比较
    3.2 ELISA检测大鼠成骨细胞中IL-6、TNF-a、OC、碱性磷酸酶含量、钙结节表达水平
    3.3 TFE对LPS诱导的大鼠成骨细胞中RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA及蛋白表达的影响
    3.4 miR-34a-5p对SMAD2表达的靶向调控作用
    3.5 过表达miR-34a-5p对LPS诱导成骨细胞中RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA及蛋白表达的影响
    3.6 抑制miR-34a-5p对LPS诱导成骨细胞中RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA及蛋白表达的影响
4 讨论

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本文编号：2867840