鹿角方中鹿角蛋白的制备及其对兔膝软骨细胞的保护作用

发布时间：2020-11-04 04:18

　　 目的:骨关节炎是一类老年人高发的退行性病变,《严氏济生方》中《鹿角丸》是治疗骨关节炎的经典方剂,但是其传统剂型服用量大,给患者带来不便。鹿角方组成参考《鹿角丸》的处方组成,对鹿角方中的鹿角蛋白进行提取工艺优化及酶解工艺优化以提高鹿角蛋白口服生物利用度;通过离体外翻肠囊实验及细胞药效的实验,为鹿角蛋白及鹿角方复方产品口服剂型开发提供药动学实验依据及为其在OA治疗方面提供药效研究基础。方法:水为提取溶剂采用冷凝回流提取鹿角中总蛋白,以蛋白质含量为考察指标,采取L9(34)正交试验,对提取时间、提取次数、液料比进行考察,优选出鹿角蛋白的提取工艺。使用市面上常见的胃蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶七种蛋白酶对鹿角蛋白进行水解作用,通过酶解物水解度及体外抗氧化活性的测定,选取合适鹿角蛋白酶解的蛋白酶。优选出风味蛋白酶及碱性蛋白酶进行鹿角蛋白双酶解工艺优化,以水解度及蛋白酶解物O_2~-·抑制率为双目标,通过Box-Behnken试验设计进行鹿角蛋白酶解响应曲面优化。建立大鼠外翻肠囊吸收模型,考察鹿角蛋白酶解前后对总氨基酸、羟脯氨酸、甘氨酸的吸收影响。通过兔膝软骨体外培养,建立IL-1β诱导软骨细胞炎症模型及H_2O_2诱导氧化损伤模型,评价药物对软骨细胞的保护作用。结果:(1)通过正交试验优化后,选择鹿角蛋白终提取工艺为:提取时间为2h,提取次数为4次,料液比1:10。(2)单酶解实验中,风味蛋白酶酶解物水解度最高,酶解330min后水解度为33.21±9.29%;风味蛋白酶解物·OH清除能力清除能力较强,酶解产物IC50为1.04 mg/m L;碱性蛋白酶酶解物O_2~-·清除效果最强,酶解产物IC50为1.87 mg/m L。(3)通过对鹿角双酶解实验结果进行拟合,得到最优双酶解工艺参数为酶解p H7.5,酶解温度51.6℃,风味蛋白酶:碱性蛋白酶比例为7:3。(4)肠吸收实验中,酶解后的鹿角蛋白的肠吸收液中,Hyp、Gly及总氨基酸的Q120及Ka较同浓度未酶解的鹿角蛋白皆有显著提高(P0.01)。(5)浓度为10μg/m L的酶解鹿角蛋白及鹿角方药物都能显著增加IL-1β诱导的软骨细胞的增殖(P0.05)。酶解鹿角蛋白及鹿角方对H_2O_2诱导的细胞氧化损都有很好的保护作用,能显著提高细胞存活率(P0.01)。酶解鹿角蛋白及鹿角方药物在100μg/m L的剂量干预下都能显著提高(P0.05)IL-1β诱导的软骨细胞内COLⅡ的含量及细胞培养上清中GAG的含量。结论:(1)通过离体外翻肠囊实验研究,鹿角蛋白经酶解工艺后,可以大幅提高Gly、Hyp及总氨基酸在小肠部位的吸收。(2)通过离体兔膝软骨培养,鹿角蛋白酶解物及鹿角方都可在一定程度上改善H_2O_2及IL-1β对兔膝软骨细胞的损伤作用。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：

olin-酚法测定蛋白质含量。取牛血清白蛋白（Bovine ser品约 30mg，精密称定，置 100mL 量瓶中，加入少量水溶即得 0.3mg/mL 的牛血清白蛋白对照品溶液母液。精密吸溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1mL 于 25mL 具塞试管中，加水补 5mL 碱性铜溶液（10g Na2CO3，2g NaOH 和 0.25g KNaCmL 蒸馏水中为试剂 A；0.5g CuSO4·5H2O 溶解于 100mL次使用前，试剂 A 与试剂 B 以 50：1 混合，现配现用） 10min；再加入 0.5mL 福林酚试剂，摇匀，室温下放置 白，在 650nm 处测定吸光度，以牛血清白蛋白含量（C）纵坐标绘制标准曲线（如图 1-1 所示），得牛血清白蛋白=1.765C+0.031，R2=0.9993 结果表明，牛血清白蛋白在 0光度值与含量呈良好的线性关系。

图 1-2 牛血清白蛋白显色后吸光度随时间的变化曲线标回收率试验量取适量供试品溶液 9 份于 10 mL 试管中，每份含 0.615mg入 0.304 mg/mL 的牛血清比蛋白对照品溶液 0.493，0.614，0，按 1.3 项下制备样品，测定，结果显示牛血清白蛋白平均加见表 1-1 所示。在高、中、低浓度下，样品回收率都能达到围，并且 RSD%为 1.82%，说明方法适用于样品的检测。表 1-1 样品加标回收率试验结果标准品（mg）加标后牛血清白蛋白含量（mg）回收率（%）平均值（%）平均值（%）0.4931.100 98.3997.931.086 95.68

广东药科大学硕士研究生学位论文白提取工艺单因素考察间对鹿角蛋白提取的影响 鹿角粉五份，按液料比 20:1 加蒸馏水，分别冷凝回流提取.5h，1h，1.5h，2h，合并提取液，以 5000r/min 的转速离心，滤液测定提取液中总蛋白含量。由表图 1-3 所示，随着提取提取总量增加，当提取时间为 0.5h 时，提取液中蛋白质的含当提取时间为 2h 时，提取液中蛋白质的含量为 1833.19mg；到 2.5h 时，提取液中蛋白质的总含量为 1797.87mg；相较 2降。这可能是长时间的高温提取对蛋白类成分有所破坏造成
【参考文献】

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本文编号：2869599