目的:探讨慈姑多糖(SSP)干预小鼠异烟肼和利福平联用(INH/RFP)药物性肝损伤以及小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用,并基于非靶向代谢组学方法,探讨SSP干预INH/RFP肝损伤小鼠和NAFLD小鼠后的血清代谢物谱,挖掘SSP干预肝损伤作用的特异性生物标志物,以探究SSP保肝作用的分子机制,为SSP开发为保肝产品提供试验依据。方法:1慈姑多糖对异烟肼和利福平联用小鼠肝损伤的保护作用及代谢组学研究1.1慈姑多糖对异烟肼和利福平联用小鼠肝损伤的保护作用24只BALB/C小鼠(20±2g)随机分为对照组(6只)、模型组(10只)、多糖组(8只)。采用INH/RFP造模,造模同时对多糖组灌胃SSP进行干预。所有小鼠每天灌胃2次,第1次为对照组和模型组灌胃生理盐水(0.8g/kg),多糖组灌胃SSP(0.8g/kg),4小时候后第2次灌胃,对照组灌胃生理盐水(0.2g/kg),模型组和多糖组灌胃INH(0.1g/kg)+RFP(0.1g/kg)。持续30天。所有小鼠禁食12小时,称重并处死。然后收集血液和肝脏样本。眼球取血后将血液离心获得血清。分别采用全自动生化分析仪进行血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量的检测以及采用HE染色方法进行肝组织病理学检查,明确模型是否复制成功,并评价SSP对INH/RFP导致肝损伤的保护作用。1.2慈姑多糖对异烟肼和利福平联用小鼠肝损伤的血清代谢组学研究分组及给药同1.1。采用UPLC-HRMS方法分析SSP干预INH/RFP联用肝损伤小鼠的血清样本,获取血清代谢物谱,并采用主成分分析(PCA)方法结合偏最小二乘(PLS-DA)方法挖掘可能的SSP干预肝损伤作用的特异性生物标志物,探究SSP保护作用机制,并采用免疫组化方法检测核转录因子2(Nrf2)、血红素加氧酶(HO-1)蛋白表达水平,从而对代谢组学研究结果中的三羧酸循环通路进行验证。2慈姑多糖对非酒精性脂肪肝小鼠肝损伤的保护作用及代谢组学研究2.1慈姑多糖对非酒精性脂肪肝小鼠肝损伤的保护作用2.1.1评价慈姑多糖对非酒精性脂肪肝小鼠糖脂代谢及炎症的影响24只雄性ICR小鼠随机分为3组(每组8只):对照组饲喂普通饲料+灌胃生理盐水(0.8g/kg)、模型组饲喂蛋氨酸-胆碱缺乏饲料(MCD)+灌胃生理盐水(0.8g/kg)、多糖组饲喂MCD饲料+灌胃SSP(0.8g/kg)。饲养12周后,所有小鼠禁食12h,称量体重,进行葡萄糖耐量试验(OGTT)。结束后麻醉,眼球取血,离心血液为血清,并取出肝组织。采用全自动生化分析仪检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、空腹血糖(FBG)、游离脂肪酸(FFA)含量;采用荧光定量PCR技术(RT-QPCR)检测肝组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL-6)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同激活因子-1α(PGC-1α)mRNA的表达;采用HE染色、油红O染色方法进行肝组织病理学检查。2.1.2评价慈姑多糖对非酒精性脂肪肝小鼠肝细胞凋亡的影响分组及给药同2.1.1。采用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)含量变化;采用荧光定量PCR技术(RT-QPCR)检测肝组织促凋亡蛋白(Bax)、抑制凋亡蛋白(Bcl-2)、沉默信息调节因子1(Sirt1)、Nrf2、HO-1mRNA水平的变化;采用透射电镜进行肝组织病理学检查;采用Western-blot方法对Nrf2蛋白进行检测。2.2慈姑多糖对非酒精性脂肪肝保护作用的代谢组学研究分组及给药同2.1.1。采用UPLC-HRMS方法分析SSP干预非酒精性脂肪肝小鼠的血清样本,获取血清代谢物谱,并采用PCA方法结合正交偏最小二乘(OPLS-DA)方法挖掘可能的SSP干预肝损伤作用的特异性生物标志物,寻找标志代谢物,探究SSP保护作用机制,并采用免疫组化方法检测Nrf2、HO-1蛋白表达水平,从而对代谢组学研究结果中的花生四烯酸代谢通路进行验证。结果:1慈姑多糖对异烟肼和利福平联用小鼠肝损伤的保护作用及代谢组学研究1.1慈姑多糖对异烟肼和利福平联用小鼠肝损伤的保护作用血清生化检测结果发现,与对照组相比,模型组AST、ALT含量升高(P0.01);与模型组相比,多糖组AST、ALT含量降低(P0.05)。HE染色结果发现,相比于对照组,模型组肝组织出现炎性浸润与坏死灶;与模型组相比,多糖组肝组织炎性浸润和坏死改善。1.2慈姑多糖对异烟肼和利福平联用小鼠肝损伤保护作用的代谢组学研究UPLC-HRMS检测发现SSP能够引起棕榈酸、鸟氨酸、天冬氨酸、琥珀酸、延胡索酸等14种代谢物水平的改变,与调节三羧酸循环、鸟氨酸循环、氨基酸循环等代谢通路相关。免疫组化方法对三羧酸循环通路进行验证,分析发现SSP引起Nrf2、HO-1表达的上调,表明SSP能够引起三羧酸循环通路上调的的研究结果可信度较高。2慈姑多糖对非酒精性脂肪肝小鼠肝损伤的保护作用及代谢组学研究2.1慈姑多糖对非酒精性脂肪肝小鼠肝损伤的保护作用2.1.1评价慈姑多糖对非酒精性脂肪肝糖脂代谢及炎症的影响模型组小鼠体重与对照组相比显著降低(P0.05),模型组与多糖组无差异。相比于对照组,模型组小鼠葡萄糖耐受能力显著下降,多糖组小鼠葡萄糖耐受能力相比于对照组显著降低,但高于模型组。血清生化分析结果发现,与对照组相比,模型组小鼠血清TG、TC、FBG、FFA水平显著升高(P0.05);与模型组相比,多糖组小鼠血清TG、TC、FPG、FFA水平显著降低(P0.05或P0.01)。HE染色结果显示模型组小鼠肝组织呈中度脂肪变性,同时伴有炎症和坏死;多糖组脂肪变性得到改善。油红O染色结果表明,模型组肝组织脂肪变性明显,多糖组脂肪变性得到改善。RT-QPCR检测发现相比于对照组,模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6 mRNA表达增强(P0.05),PGC-1α mRNA表达降低(P0.01);相比于模型组,多糖组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6mRNA表达显著降低(P0.05或P0.01),PGC-1α mRNA表达升高(P0.01)2.1.2评价慈姑多糖对非酒精性脂肪肝肝细胞凋亡的影响血清生化分析结果发现,与对照组相比,模型组小鼠血清ALT、AST、LDLC水平显著升高(P0.01);HDLC水平显著降低(P0.05)。与模型组相比,多糖组小鼠血清ALT、AST、LDLC水平显著降低(P0.05或P0.01);HDLC水平显著升高(P0.05)。透射电镜观察肝组织线粒体,发现模型组小鼠肝组织线粒体出现肿胀、变形、线粒体嵴消失等表现,多糖组线粒体肿胀、变形、线粒体嵴消失等损伤得到改善。RT-QPCR检测发现相比于对照组,模型组小鼠肝组织中Bax mRNA表达升高(P0.01),Bcl-2、Sirt1、Nrf2、HO-1 mRNA表达降低(P0.05);相比于模型组,多糖组小鼠肝组织中Bax mRNA表达减低(P0.01),Bcl-2、Sirt1、Nrf2、HO-1 mRNA表达升高(P0.05)。Western-blot方法检测发现Nrf2蛋白在模型组中表达降低(P0.05),在多糖组中升高(P0.05)。2.2慈姑多糖对非酒精性脂肪肝保护作用的代谢组学研究UPLC-HRMS检测发现SSP能够引起棕榈酸、花生四烯酸、白三烯A4、白三烯B4等33种代谢物水平的改变,并调节花生四烯酸代谢通路。免疫组化方法分析发现SSP引起Nrf2、HO-1蛋白表达的上调,表明SSP能够调节花生四烯酸代谢通路的结果可信度较高。结论:SSP对INH/RFP小鼠肝损伤具有保护作用,其机制可能与调节三羧酸循环、牛磺酸代谢、支链氨基酸代谢和脂肪酸代谢等通路有关。SSP可能通过调节糖脂代谢、改善炎症、抑制肝细胞凋亡,发挥对NAFLD小鼠肝损伤的保护作用,其机制可能还与调节花生四烯酸代谢途径有关。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
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