由于海洋环境的特殊性,使得海洋中的微生物与其宿主生物在长期共同进化过程中形成了特有的代谢途径,产生了许多活性显著的次级代谢产物参与自身防御。这些化学物质可能的生态作用为活性物质的发现提供了重要线索,引起了天然产物领域学者的关注,开启了对海洋微生物的研究。近年来,对海洋微生物次级代谢产物的研究已成为海洋药物研究的热点。本课题组主要从事海洋无脊椎动物及其共附生微生物的活性次级代谢产物研究,对我国东沙、西沙海域的海洋无脊椎动物(珊瑚、海绵)及其共附生微生物的化学成分进行了系统研究。作为本课题组从海洋微生物中寻找活性物质工作的延续,本研究对我国东沙来源的珊瑚中共附生微生物进行分离纯化,经过化学筛选,选取三株化学成分丰富的珊瑚共附生真菌Alternaria sp.Strain DX-FOF7、Aspergillus flavipes以及Trametes hirsute,对其化学成分和生物活性进行考察,以期得到活性物质。采用正、反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及制备高效液相等多种色谱分离手段,对以上3种真菌的发酵液进行分离纯化。采用核磁共振、高分辨质谱、红外等多种现代结构鉴定技术,结合文献检索,对化合物结构进行鉴定;采用多种体外活性筛选模型对化合物的生物活性进行评价。从豆荚软珊瑚属珊瑚(Lobophytum sp.)共附生真菌Alternaria sp.Strain DX-FOF7发酵液中分离得到15个化合物:macrophorin A(A1),(1R,5R,6R)-5-hydroxyl-4-(hydroxymethyl)-1-(((1S,4a R,8a R)-5,5,8a-trimethyl-2-methylene-6-oxodecahydronaphthalen-1-yl)methyl)-7-oxabicyclo[4.1.0]hept-3-en-2-one(A2),methyl 2-hydroxy-3-(((3-hydroxyl-3-(2-((1S,4aR,6S,8aR)-6-hydroxy-5,5,8a-trimethyl-2-methylenedecahydronaphthalen-1-yl)acetyl)-5-oxocyclopent-1-en-1-yl)methyl)thio)propanoate(A3),butyrolactone I(A4),aspernolide A(A5),aspterric acid(A6),1-O-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-glycerol(A7),wasabidienone E(A8),(2S,5S,7S)-3a-hydroxyl-exogonic acid(A9),cephalosporolides E(A10),cephalosporolides F(A11),terrein(A12),penicillic acid(A13),territrems B(A14),(9R)-territrems B(A15)经检索,化合物A3和A15为新化合物,化合物A3鉴定为新骨架化合物,其余化合物均为首次从该株真菌中分离得到。从短足软珊瑚属珊瑚(Cladiella sp.)共附生真菌Aspergillus flavipes中分离得到7个化合物:trichalasin H(B1),aspergilluchalasin(B2),aspochalasin I(B3),aspochalasin D(B4),aspochalasin E(B5),aspochalasin K(B6),penilumamide(B7),化合物B7为肽类化合物。经检索发现,化合物B7为首次从该株真菌中分离得到。从短足软珊瑚属珊瑚(Cladiella sp.)共附生真菌Trametes hirsute中分离得到9个化合物:3β-Hydroxy(22E,24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one(C1),ergosterol peroxide(C2),5α,6α-epoxy-(22E,24R)-ergosta-8,22-diene-3β,7β-diol(C3),3β-pregn-5-ene-20-one-3-ol(C4),proloquatifoligenin III(terpene glycoside)(C5),(3R,6E,10S)-2,6,10-trimethyl-3-hydroxydodeca-6,11-diene-2,10-diol(C6),cepharosporolide C(C7),Methyl 4-hydroxybenzoate(C8),N-Acetyltyramine(C9)。经检索发现,本次研究为首次从该属珊瑚中分离得到真菌Trametes hirsute,化合物C1-C9均为首次从该株真菌中分离得到。采用CCK-8法对化合物B1-B7,C1-C9进行抗肿瘤活性测试,以目前临床上发病率较高的人非小细胞肺癌(A549),前列腺癌(PC-3),肝癌(Bel-7404)和人髓性白血病细胞(K562)作为研究对象,对化合物抗肿瘤活性进行初步筛选,结果显示,化合物B1,B3,B4,B6,C2,C3显示出一定的细胞毒活性,其余化合物IC_(50)值均在100μM以上。采用核因子κB受体活化因子配基(RANKL)诱导小鼠骨髓单核巨噬细胞(Bone marrow macrophagecells,BMMs)分化为成熟的破骨细胞,经抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)特异性染色,检测化合物B1-B7,C1-C9对小鼠BMMs向破骨细胞分化的影响。结果显示,化合物B3和B4能显著抑制BMMs向破骨细胞分化,化合物C1和C3能促进BMMs向破骨细胞分化。采用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记,流式细胞仪检测化合物A1-A13,B1-B7对小鼠T淋巴细胞增殖的调节活性;采用APC-CD3、APC-CD4、APC-CD8抗体标记,流式细胞仪检测,评价了以上化合物对T淋巴细胞分化调节的影响。结果显示以上化合物对小鼠T淋巴细胞的增殖和分化未表现出明显的生物活性。采用PD-1/PD-L1结合分析试剂盒,对化合物A1-A13,B1-B7对PD-1/PD-L1蛋白结合抑制活性进行测试。结果显示,部分受试化合物在100μM浓度下对PD-1/PD-L1蛋白结合显示出一定的抑制活性。本研究从三株珊瑚共附生真菌中共分离并鉴定了31个化合物,包括2个新化合物,其中1个为新骨架化合物,24个化合物为首次从其各自真菌中分离得到,首次对真菌Trametes hirsute的化学成分进行系统研究。采用多种活性评价模型对部分化合物进行了活性测试,筛选得到4个具有调节破骨细胞分化活性的化合物。以上研究对海洋天然产物的结构类型和数量进行了扩充,对骨代谢疾病、以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节抗肿瘤研究提供了一定参考,为课题组进一步寻找活性先导化合物提供了一定化合物基础,为我国海洋资源的合理利用提供了研究资料。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284.1
【部分图文】：
海军军医大学硕士学位论文（四）结果与讨论本实验中采用核因子κB受体活化因子配基 (RANKL) 诱导小鼠骨髓单核巨噬细胞 (BMMs) 分化为成熟的破骨细胞，经抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 特异性染色，考察受试化合物对小鼠单核巨噬细胞向破骨细胞分化的作用。结果显示，化合物 B3 和 B4 能显著抑制 BMMs 向破骨细胞分化，化合物 C1 和 C3 能促进BMMs 向破骨细胞分化。表明这化合物 B3 和 B4 对新型抗骨质疏松药物的研究可能具有重要意义，化合物 B3 和B4 在结构上都含有C-13, 14 和C-19, 20 双键，推测活性的存在可能与这两个位置的双键有关。
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本文编号：
2874564
