镉是环境中常见的重金属高毒性污染物,急慢性镉暴露均能引起多种器官和组织的损伤。肾脏是镉毒性作用的重要靶器官,镉暴露时引起的氧化应激和代谢紊乱均会导致肾脏损伤和细胞凋亡。葛根素是从中药野葛根中提取的一种植物异黄酮,因其毒性低、代谢快且具有抗氧化、降血糖等作用,已在临床上应用于心血管疾病和糖尿病并发症的治疗。AMPK是机体能量代谢的感应中心,缺血、缺氧或中毒时引起的机体代谢紊乱可激活AMPK/AKT信号通路,以此调节代谢平衡,保护机体免于进一步损伤。本文体内和体外相结合,以大鼠和大鼠原代肾小管上皮细胞为模型,研究葛根素对镉致肾脏损伤的保护效应。1.镉暴露致大鼠肾脏损伤及葛根素的保护效应选用SD大鼠40只,随机分为4组,对照组(无处理)、染毒组(CdAc2,2.5mg/kg·bw)、保护组(PU,200mg/kg·bw;CdAc2,2.5mg/kg·bw)、葛根素对照组(PU,200mg/kg·bw),处理周期为5周,其中PU每天灌胃,CdAc2在最后一周连续注射7d。实验结束后,剖杀采集肾皮质、全血、血清和尿液进行后续实验。利用原子吸收光谱法测定大鼠肾皮质、血清、尿液的镉含量;血液常规分析仪测定大鼠血糖含量;可见光分光光度计测定大鼠血清丙二醛含量(MDA)、总超氧化物歧化酶活性(T-SOD)与总抗氧化能力(T-AOC);石蜡切片观察肾脏病理变化;血液生化仪检测血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(CREA)、尿β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和β2微球蛋白((β2-MG)含量;QRT-PCR检测肾皮质中自噬相关基因和AMPK通路相关基因的表达;Western blot检测大鼠肾皮质中凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白和AMPK通路相关蛋白的表达量。结果表明:①镉在染毒组大鼠体内的蓄积量极显著高于对照组(P0.01),而保护组大鼠体内的镉蓄积量显著低于染毒组(P0.01);②染毒组大鼠血清MDA含量显著高于对照组(P0.01),T-SOD活性与T-AOC均低于对照组(P0.01),而保护组大鼠血清MDA含量显著低于染毒组(P0.01),T-SOD活性和T-AOC均显著高于染毒组(P0.01或P0.05);③染毒组大鼠血糖含量显著高于对照组(P0.01),保护组大鼠血糖显著低于染毒组(P0.05);④染毒组大鼠肾小管变性、肿胀、管腔狭窄,肾间质大量红细胞浸润,肾小球充血,保护组大鼠病变减轻;⑤染毒组大鼠血清BUN和CREA含量均显著高于对照组(P0.01),保护组大鼠血清BUN和CREA含量均显著低于染毒组(P0.01);⑥染毒组大鼠尿液中NAG和β2-MG含量均显著高于对照组(P0.01),保护组大鼠尿液中NAG含量显著低于染毒组(P0.05),但β2-MG含量无明显变化(P0.05);⑦染毒组大鼠肾皮质Cleaved caspase-3、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 蛋白表达量显著高于对照组(P0.01 或P0.05),Beclin1 表达量显著低于对照组(P0.01),LC3II/LC3I、ATG5、p62、p-AMPK/AMPK表达量均无明显变化(P0.05);保护组大鼠肾皮质LC3II/LC3I、ATG5、Beclin1、p-AMPK/AMPK 表达量均显著高于染毒组(P0.01 或P0.05),p62、Cleaved caspase-3、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表达量显著低于染毒组(P0.01或P0.05);⑧染毒组大鼠肾皮质LC3、P62、BECN1、AKT、mTOR基因表达水平显著高于对照组(P0.01或P0.05),ATG5、AMPK表达水平无明显变化,保护组大鼠肾皮质LC3、ATG5、BECN1、AMPK表达水平显著高于染毒组(P0.01或P0.05),P62、AKT、mTOR基因表达水平显著低于染毒组(P0.01 或 P0.05)。根据以上结果可以得出以下结论:①镉暴露可引起大鼠发生氧化损伤和代谢紊乱;②镉暴露引起大鼠肾小管和肾小球损伤,并导致细胞凋亡;③葛根素可缓解镉引起的氧化损伤,调节代谢平衡;④葛根素可通过AMPK/AKT信号通路调节自噬,拮抗镉引起的细胞凋亡。2.镉暴露致大鼠肾小管上皮细胞损伤及葛根素的保护效应采用机械筛网结合酶消化法建立大鼠原代肾小管上皮细胞(rPT细胞)培养模型,在对数生长期时,将rPT细胞分为4组:对照组(无处理)、染毒组(10μMCdAc2)、保护组(50μMPU,1OμMCdAc2)、葛根素对照组(50μMPU);或对照组(无处理)、染毒组(10μMCdAc2)、Cd+AICAR组(500OμMAICAR,1OμM CdAc2)、AICAR对照组(5000μMAICAR);或对照组(无处理)、Cd+Dor组(50μMDor,1μM CdAc2)、Cd+PU+Dor组(50μM Dor,50μMPU,10μM CdAc2)、Dor对照组(50μMDor)。CCK-8法检测各组rPT细胞活力,萤火虫荧光素酶发光法检测各组细胞内ATP含量,DCFH-DA探针法检测各组细胞内ROS水平,透射电镜观察各组细胞超微结构,AnnexinV-FITC/PI进行双染并使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,DAPI探针染色激光共聚焦技术检测细胞核凋亡形态学变化,MDC探针染色激光共聚焦技术观察细胞内自噬囊泡数量,RFP-LC3质粒转染激光共聚焦技术观察荧光聚点,GFP-RFP-LC3双标质粒转染激光共聚焦观察细胞自噬流,Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白和AMPK通路相关蛋白的表达量。结果表明:①染毒组细胞活力和ATP水平显著低于对照组(P0.01或P0.05),ROS水平显著高于对照组(P0.01),保护组细胞活力和ATP水平显著高于染毒组(P0.01或P0.05),ROS水平显著低于染毒组(P0.01);②染毒组细胞中各细胞器受损、线粒体肿胀并出现不同程度的破损和空泡化,保护组细胞中出现自噬溶酶体,降解受损细胞器;③染毒组细胞凋亡率显著高于对照组(P0.01),保护组细胞凋亡率显著低于染毒组(P0.01);④染毒组细胞自噬体数量显著多于对照组(P0.01或P0.05)但自噬流受阻,保护组细胞自噬体数量显著多于染毒组(P0.05)且自噬流顺畅;⑤染毒组细胞LC3II/LC3I、ATG5、Cleaved caspase-3、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达量显著高于对照组(P0.01或P0.05),Beclin1表达量显著低于对照组(P0.01),p-AMPK/AMPK、p62表达量均无明显变化,保护组细胞LC3II/LC3I、ATG5、Beclin1、p-AMPK/AMPK表达量均显著高于染毒组(P0.01 或P0.05),p62、Cleaved caspase-3、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表达量显著低于染毒组(P0.01或P0.05);⑥经AMPK激动剂AICAR处理后,Cd+AICAR组细胞内LC3II/LC3I、ATG5、Beclin1表达量均显著高于Cd组(P0.01或P0.05),p62、Cleavedcaspase-3表达量均显著低于对照组(P0.01或P0.05),单独染Cd组细胞内LC3Ⅱ/LC3I、ATG5、p62、Cleavedcaspase-3表达量均显著高于对照组(P0.01或P0.05),Beclin1表达量显著低于对照组(P0.01);⑦经AMPK抑制剂Dor处理后,Cd+PU+Dor组细胞内p-AKT/AKT表达量显著高于Cd+PU组(P0.01),p-AMPK/AMPK表达量显著显著低于Cd+PU+Dor组(P0.05),p-mTOR/mTOR表达量无明显变化;Cd+PU组细胞内p-AMPK/AMPK、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表达量显著高于对照组(P0.01或P0.05)。根据以上结果可以得出以下结论:①镉可引起rPT细胞活力下降、形态和超微结构的损伤、氧化损伤和代谢异常;②镉可引起rPT细胞自噬流受阻,并导致细胞凋亡;③葛根素可缓解镉引起的rPT细胞损伤,维持代谢平衡;④葛根素可通过激活AMPK通路调节自噬,拮抗镉引起的rPT细胞凋亡。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
?ｓｅｒｕｍ?ｕｒｉｎｅ??图２－１处理结束时大鼠肾皮质、血清及尿液中的镉含量??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｍｅｔａｌ?ｌｅｖｅｌｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｕｒｉｎｅ，?ｓｅｒｕｍ?ａｎｄ?ｒｅｎａｌ?ｃｏｒｔｅｘｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｒａｔｓ?ａｔ?ｔｈｅ?ｅｎｄ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ??（ｎｓ?尸＞０．０５，＊＊?尸＜０．０１）??３．１．２葛根素缓解镉导致的大鼠生长缓慢与血糖升高??通过每天记录各组大鼠体重变化（图２－２－１），前四周各组大鼠体重均匀增长且涨幅无??明显变化，但在第五周染毒时，染毒组大鼠与其余三组大鼠相比，体重涨幅减缓但无显著??差异（Ｐ＞０．０５）；??５?令?Ｃｏｎｔ??＋?Ｃｄ??一?５００－?士?Ｃｄ＋ＰＵ??！：：：?＾ｐｕ??１３５〇－??３００?１?Ｉ?１?Ｉ?１???Ｗ１?Ｗ２?Ｗ３?Ｗ４?Ｗ５??图２－２－１镉对大鼠体重变化的影响??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２－１?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｃａｄｍｉｕｍ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｂｏｄｙ?ｗｅｉｇｈｔ?ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ｒａｔｓ??所测各组大鼠血糖含量见图２－２－２，对照组与葛根素组大鼠血糖无明显变化（Ｐ＞０．０５），??但镉组大鼠血糖升高为对照组大鼠的１．５倍，而保护组大鼠血糖含量则降为镉组大鼠的０．８??倍。说明镉暴露能引起大鼠血糖显著升高（户＜〇．〇１）
３．１．３葛根素通过提高抗氧化能力缓解镉导致的机体氧化损伤??所测各组大鼠血清丙二醛（ＭＤＡ）含量、总超氧化物歧化酶（Ｔ－ＳＯＤ）活性与总抗氧??化能力（Ｔ－ＡＯＣ）见图２－３，对照组与葛根素组大鼠血清ＭＤＡ含量、Ｔ－ＳＯＤ活性与Ｔ－ＡＯＣ??均无明显变化（Ｐ＞〇．〇５），但染毒组大鼠血清ＭＤＡ含量升高为为对照组的１．３倍，Ｔ－ＳＯＤ??活性与Ｔ－ＡＯＣ分别降低为对照组的０．８倍和０．５倍；而保护组大鼠血清ＭＤＡ、Ｔ－ＳＯＤ与??Ｔ－ＡＯＣ分别为染毒组的０．６倍、１．１倍和１．５倍。说明镉暴露能造成大鼠机体脂质过氧化水??平显著升高（ＰｃＯ．Ｏｌ），抗氧化能力显著降低（户＜〇．〇１），而葛根素能够显著）缓解镉导致??的大鼠机体氧化损伤并显著提高其抗氧化能力（Ｐ＜０．０１?）。??？ｋｉｅ?＊??ｉ?”?＊＊?＊＊?ｐ＾ｎｎ?■???ＩＩＪ?Ｔ?＿?Ｒｊ??＾?ｎｓ?Ｉ?ｍｍ?Ｉｍ?Ｍ?Ｃｄ??８４？门?ｉ?＊＊?＊＊?■圍?Ｑ，?Ｃｄ＋ＰＵ??［ｌｌｌＪ?Ｓｒ?１１１??ＭＤＡ?ＳＯＤ?ＡＯＣ??图２－３镉和葛根素对大鼠机体抗氧化能力的影响??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｃａｄｍｉｕｍ?ａｎｄ?ｐｕｅｒａｒｉｎ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｂｏｄｙ＇ｓ?ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ?ｃａｐａｃｉｔｙ?ｏｆ?ｒａｔｓ??（ｎｓＰ＞０．０５，?＊Ｐ＜０．０５，?＊＊Ｐ＜０．０１）??
§?〇?，?，???Ｉ?Ｃｏｍ?ＰＵ?Ｃｄ?Ｃｄ＋ＰＵ??图２－２－２镉和葛根素对大鼠血糖水平的影响??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２－２?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｃａｄｍｉｕｍ?ａｎｄ?ｐｕｅｒａｒｉｎ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｂｌｏｏｄ?ｇｌｕｃｏｓｅ?ｌｅｖｅｌｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ??（ｎｓ?Ｐ＞０．０５，?＊Ｐ＜０．０５，?＊＊?戶＜０．０１）??葛根素通过提高抗氧化能力缓解镉导致的机体氧化损伤??测各组大鼠血清丙二醛（ＭＤＡ）含量、总超氧化物歧化酶（Ｔ－ＳＯＤ）活性与总抗氧??（Ｔ－ＡＯＣ）见图２－３，对照组与葛根素组大鼠血清ＭＤＡ含量、Ｔ－ＳＯＤ活性与Ｔ－ＡＯＣ??显变化（Ｐ＞〇．〇５），但染毒组大鼠血清ＭＤＡ含量升高为为对照组的１．３倍，Ｔ－ＳＯＤ??Ｔ－ＡＯＣ分别降低为对照组的０．８倍和０．５倍；而保护组大鼠血清ＭＤＡ、Ｔ－ＳＯＤ与??Ｃ分别为染毒组的０．６倍、１．１倍和１．５倍。说明镉暴露能造成大鼠机体脂质过氧化水??升高（ＰｃＯ．Ｏｌ），抗氧化能力显著降低（户＜〇．〇１），而葛根素能够显著）缓解镉导致??鼠机体氧化损伤并显著提高其抗氧化能力（Ｐ＜０．０１?）。??？ｋｉｅ?＊??
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本文编号：
2876204
