雷公藤甲素在胶质瘤细胞迁移、侵袭及EMT样表型变化中的研究

发布时间：2020-11-09 21:01

　　 目的:观察雷公藤甲素对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及EMT样表型的影响,并探讨引起EMT表型改变的可能机制。方法:雷公藤甲素作用于U87、U251胶质瘤细胞系,CCK-8法检测TP对两种细胞的半数抑制浓度IC_(50),及IC_(50)浓度下细胞的增殖能力受到抑制的情况。细胞的迁移能力通过细胞划痕实验来检测,细胞的侵袭能力则通过Transwell侵袭实验检测。Western Blot分析TP作用于细胞后,上皮间质化(EMT)标志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、Slug等蛋白表达水平,同时检测自噬标志物LC3B、Beclin-1、Atg-7。转染pEGFP-C2-LC3B质粒进入胶质瘤细胞,细胞免疫荧光检测TP对细胞自噬的影响。裸鼠皮下瘤实验检测TP在体内对肿瘤细胞的增殖抑制情况,免疫组化检测肿瘤组织EMT标志物的表达水平。结果:U87、U251细胞在雷公藤甲素的作用下,其增殖活力受到明显的抑制,而且这种抑制效应呈现出随着剂量、时间的增加而增加的趋势。U87细胞的半数抑制浓度IC_(50)为20ng/ml,而U251细胞的IC_(50)为50ng/ml。雷公藤甲素对胶质瘤细胞系U87、U251细胞的迁移、侵袭能力有明显的抑制作用。Western Blot实验表明TP在胶质瘤细胞中逆转了EMT的过程,即以E-Cadherin为代表的上皮标志物出现表达上调,而以N-Cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、Slug等为代表的间质标志物则出现表达下调。雷公藤甲素引起胶质瘤细胞自噬增强,LC3B II/I比值升高,Beclin-1、Atg-7表达上调。细胞免疫荧光显示TP作用于细胞后自噬小体数量明显增多。裸鼠皮下瘤实验在体内验证了TP对胶质瘤细胞的增殖抑制作用。免疫组化证实TP作用后肿瘤组织EMT标志物E-Cadherin出现表达上调,而间质标志物,如N-Cadherin、Vimentin则出现表达下调。结论:雷公藤甲素能抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭,并逆转上皮间质化(EMT)进程,而引起EMT逆转的可能机制为雷公藤甲素诱导胶质瘤细胞发生自噬增强:由自噬介导通过ZEB1、Snail等通路改变E-cadherin和Vimentin表达,从而抑制EMT进程。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285
【部分图文】：

第 3 章 结果第 3 章 结果3.1 计算半数抑制浓度 IC50不同浓度的 TP（1、5、10、20、50、100、200、400ng/ml）对 U87、U251这两种细胞系的细胞处理 48h，采用 CCK-8 法检测 OD 值，将所得的 OD 值转换为与 TP 0ng/ml 组相比的细胞增殖活力百分比，通过 SPSS 软件计算出两种细胞系的半数抑制浓度IC50，其中U87的IC50为20ng/ml，而U251的IC50为50ng/ml（如图 3-1 所示）。

图 3-2 CCK8 检测 TP 作用 7 天 U87、U251 细胞增殖活力的改变。A. U87 细胞在 20ng/ml TP作用下细胞增殖活力的变化；B. U251 细胞在 50ng/ml TP 作用下细胞增殖活力的变化。（*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC 组）3.3 划痕实验检测 TP 对胶质瘤细胞迁移的影响U87 细胞选择了 0h、12h、24h 三个时间点观察细胞的迁移能力，发现 TP能明显抑制细胞迁移。U251 细胞的迁移较慢，所以延长观测时间至 48h，结果在 48h 的观测点，同样发现与对照组相比，TP 能明显抑制细胞的迁移（图 3-3）。

2 CCK8 检测 TP 作用 7 天 U87、U251 细胞增殖活力的改变。A. U87 细胞在 20ng/下细胞增殖活力的变化；B. U251 细胞在 50ng/ml TP 作用下细胞增殖活力的变化＜0.05，**P＜0.01 vs NC 组）划痕实验检测 TP 对胶质瘤细胞迁移的影响U87 细胞选择了 0h、12h、24h 三个时间点观察细胞的迁移能力，发现显抑制细胞迁移。U251 细胞的迁移较慢，所以延长观测时间至 48h，8h 的观测点，同样发现与对照组相比，TP 能明显抑制细胞的迁移（图
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本文编号：2876966