蚕沙资源化学与菌群组成分析及抗类风湿性关节炎功效评价

发布时间：2020-11-09 22:29

　　 第一章文献综述本章对蚕沙的药用历史渊源进行了较为系统的归纳整理,阐明了蚕沙的祛风除湿功效与类风湿性关节炎间的关系,并综述了蚕沙的现代研究进展,其中包括蚕沙的资源性化学成分研究、药理作用研究及相关应用进展,为蚕沙资源的开发和合理利用提供科学依据。第二章蚕沙资源性化学成分分析与评价为明确蚕沙中资源性化学成分的组成及分布特征,本章以不同产地、不同龄期的蚕沙为研究对象,对其进行了性状鉴定;分别采用高效液相色谱法(HPLC-PAD)、液相-质谱联用技术(UPLC-TQ/MS)等方法,对不同产地、不同龄期蚕沙中的黄酮类、生物碱类、核苷类、氨基酸类、多糖类和叶绿素等化学成分进行分析与评价,为进一步研究提供依据,结果如下:1.黄酮类成分分析结果显示,蚕沙中主要含有异槲皮苷、紫云英苷、芦丁,3种黄酮类成分。不同产地、不同龄期蚕沙分析结果表明收集于大理的蚕沙3种黄酮类成分显著高于其他产地,其次为收集于重庆的蚕沙,含量也相对较高。此外,龄期较高的蚕沙所含黄酮类成分含量反而较低,其含量顺序为三龄四龄五龄。2.生物碱类成分分析结果显示,蚕沙中生物碱类成分含量较为丰富,1-脱氧野尻霉素和荞麦碱二者总量在0.1%以上,其中收集于苏州的蚕沙生物碱含量最高,为1.63mg/g,其次为收集于镇江的蚕沙,且随着龄期的延长,蚕沙生物碱类成分含量相应增加。3.核苷类、氨基酸类成分分析结果显示,共测出5种核苷类成分、14种氨基酸类成分。其中收集于苏州的蚕沙核苷类、氨基酸类总含量最高,为2.61mg/g,广西蚕沙最低,为0.58mg/g。蚕沙中含量较高的氨基酸分别为L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-α-丙氨酸、L-谷氨酸和L-苏氨酸。4.多糖类成分分析结果显示,蚕沙中多糖类成分含量十分丰富,粗多糖含量约为9%,其中收集于苏州、桐乡、镇江的蚕沙多糖含量接近,收集于大理的蚕沙多糖含量最高,为11.85%,且随着龄期的延长多糖含量有下降的趋势。5.叶绿素含量测定结果显示,蚕沙中的叶绿素含量总体较高约为0.2%,所有蚕沙样品中叶绿素a的含量均明显高于叶绿素b,收集于镇江的三龄蚕沙所含叶绿素含量最高,为2.62mg/g,收集于广西的蚕沙叶绿素含量显著低于其他各产地;收集于大理、桐乡、重庆的蚕沙叶绿素含量较为相近,且蚕沙龄期越大,叶绿素含量越低。第三章蚕沙菌群结构的分析与鉴定采用Illumina MiSeq第二代测序平台对蚕沙菌群16S rDNA进行测定,并通过α多样性分析、β多样性分析、LefSe分析、Metastats分析、主坐标分析、群落代谢功能预测等多种方式来比较烘干处理前后蚕沙菌群的差异性及产地、龄期对蚕沙菌群结构的影响,以期为蚕沙的品质与安全性评定及功能主治提供新的科学依据。1.烘干处理对蚕沙菌群结构的影响以镇江产新鲜家蚕粪便及干燥蚕沙为研究对象,测定其16S rDNA-V4区序列,并进一步分析比较。结果发现,低温烘干后蚕沙菌群结构发生了显著改变,其中柠檬酸杆菌属、爱文氏菌属显著增多,甲基杆菌属、链球菌科、蓝细菌、甲基杆菌科、芽孢杆菌属和0319_6G20科菌显著降低,从菌群角度说明了家蚕粪便在入药时要经过适当加工处理,鲜品不适于入药。2.产地、龄期对蚕沙菌群结构的影响对比分析不同产地、不同龄期蚕沙中菌群组成的差异性及代谢功能的差异性。结果发现蚕沙主要由变形菌门、放线菌门和厚壁菌门组成,不同产地的蚕沙差异较大,广西产蚕沙明显有别于其他产地;不同龄期蚕沙菌群结构较为相似,其中放线菌门有逐渐减少的趋势,表明随着龄期的延长,蚕沙中的菌群结构也随之发生改变。第四章蚕沙对佐剂型关节炎大鼠的改善作用及机制研究1.以蚕沙中3中黄酮类成分含量为考察因素,通过正交实验得到黄酮类成分的最佳提取工艺为60%乙醇,1:12,提取2次,每次1h,并按此条件制备蚕沙醇提物,最后对蚕沙水提物与醇提物进行成分分析,明确给药部位的成分组成,其中水提物多糖类成分含量高达43%,生物碱、黄酮类成分含量同原药材相比也有显著提高。2.采用弗氏完全佐剂诱导的佐剂型关节炎大鼠(AA)为研究对象,对苏州产蚕沙水提取物及醇提取物的抗类风湿性关节炎功效进行评价。连续给药21天,收集大鼠的血清、膝关节滑膜和踝关节,分别进行生化指标测定、Western bloting法分析膝关节滑膜组织中信号蛋白表达及踝关节病理切片分析。结果表明,蚕沙提取物能够通过抑制促炎因子异常增高,改善AA大鼠的氧化应激水平,缓解骨破坏,调节NF-κB和MAPKs通路,从而起到对类风湿性关节炎的治疗作用。3.基于代谢组学技术研究蚕沙提取物对AA大鼠的干预作用,选取实验大鼠的血清、尿液样本进行分析测定。共鉴定出33种内源性代谢物(血清中10种、尿液中23种),及6条靶标代谢通路,分别为烟酸和烟酰胺代谢;戊糖、葡萄糖醛酸转换;乙醛酸和二羧酸代谢;β-丙氨酸代谢;嘌呤代谢及糖酵解、葡萄糖生成。经过蚕沙的干预后,相关代谢物均有所回调,说明蚕沙提取物可通过调节AA大鼠的体内代谢来改善症状。4.收集实验大鼠的新鲜粪便,通过16S rDNA测序的方法研究蚕沙提取物对于AA大鼠肠道菌群的调节作用。研究发现,同正常组相比,AA大鼠肠道菌群发生了显著改变。在属水平上,模型组大鼠粪便中S24-7、拟杆菌属、疣微菌科和梭菌显著增多,乳酸杆菌、考拉杆菌属、瘤胃球菌属和Adlercreutzia菌显著减少,各给药组差异菌群在治疗后得到不同程度的改善,提示蚕沙具有一定的改善AA大鼠肠道菌群失调的作用。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285;R284
【部分图文】：

记录峰面积，计算 3 种成分的 RSD 值。2.8 加样回收率试验取苏州蚕沙样品粉末，精密称定，分别按已知质量分数的 80%、100%、120%加入紫云英苷、异槲皮苷与芦丁对照品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液后，在“2.3”项条件下进行测定，记录峰面积，计算加样回收率及 RSD 值。2.9 样品分析评价供试溶液分别按照“2.2”项下方法制备，按“2.3”项条件下进行测定，记录峰面积，计算质量分数。3. 结果3.1 色谱及质谱分析检测条件的确定本实验所用色谱及质谱分析检测条件可使蚕沙中 3 种黄酮类成分达到有效分离，能够用于测定蚕沙中的异槲皮苷、紫云英苷、芦丁，色谱图见图 2-2-1。

蚕沙资源化学与菌群组成分析及抗类风湿性关节炎功效评价线性回归方程如下表 2-2-6。表 2-2-6 线性回归方程Table 2-2-6 The results of linear regression equation化合物 回归方程 r2线性范围 (μg·mDNJ y = 1412.6x – 145.16 0.9999 0.18~72.00Fagomine y = 4517.9x + 3077.8 0.9969 0.08~35.00量测定结果按上述分析测定条件得到 DNJ 及 Fagomine 的色谱图如下图 2-2-2，从图中可明显设定的色谱和质谱条件下，两种生物碱可以完全分开，并得到较为干净、漂亮的

图 2-2-3 所测定化合物结构式Figure 2-2-3 Determination of the structure of compounds2. 方法与结果2.1 对照品溶液制备称取干燥至恒重的对照品适量，以超纯水配制成化合物 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyacid）、L-亮氨酸（L-Leucine）、L-甲硫氨酸（L-Methionine）、L-苯丙氨酸（L-phenylalanine）L-色氨酸（L-Tryptophan）、L-苏氨酸（L-Threonine）、L-α-丙氨酸（L-Alanine）、L-瓜氨（L-Citrulline）、L-谷氨酸（L-Glutamincacid）、L-谷氨酰胺（L-Glutamin）、L-天冬酰胺（Asparagine）、鸟苷（Guanosine）、L-缬氨酸（L-Valine）、L-脯氨酸（L-Proline）、胞苷（Cytidine腺嘌呤（Adenine）、L-赖氨酸（L-Lysine）、胸苷（Thymidine）、肌苷（Inosine）质量浓度别为 0.101、0.192、0.067、0.220、0.162、0.144、0.284、0.129、0.303、0.151、0.150、0.1160.174、0.118、0.126、0.096、0.114、0.116、0.203 mg·mL-1的混合对照品溶液。2.2 供试品溶液的制备
【参考文献】

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本文编号：2877041