乌榄叶提取物体内外抗氧化作用的初步研究

发布时间：2020-11-11 08:16

　　 背景:我国慢性病死亡人数占总死亡人数的86.6%;大量研究表明,抗氧化应激是控制慢性病发生和发展的重要因素;抗氧化剂可以用来缓解氧化应激的发生,但是目前人工合成抗氧化剂的安全性受到了大家广泛的质疑,因此寻找安全有效的天然抗氧化剂是亟待解决的问题;乌榄叶全年可采收,资源丰富,研究发现具有较强的清除氧自由基、抗衰老作用,但对其药效和机制未进行深入研究;因此研究乌榄叶抗氧化作用并初步推断其作用机制具有重要的经济价值和应用价值。目的:本研究针对乌榄叶的成分和在体内外抗氧化活性进行初步的探讨,旨在为乌榄叶的开发和天然抗氧化剂的研究提供科学依据。方法:1.(1)采用比色法测定乌榄叶不同提取物中总黄酮、多酚、皂苷、多糖含量;(2)通过测定乌榄叶的自由基清除力、还原力、抗脂质过氧化等,评价其抗氧化活性;(3)使用Perman分析含量与抗氧化能力的相关性。2.(1)以总黄酮的含量为指标,结合正交试验结合,确定最优提取工艺;(2)纯化得到榄叶黄酮化合物(TFCPL)后考察其抗氧化活性。3.(1)采用注射D-半乳糖方法建立氧化损伤模型小鼠,取小鼠肝脏、肺等脏器进行HE染色并观察;使用紫外分光光度法和酶板法测定小鼠血清、肝脏和脑中MDA含量及T-AOC、GSH-PX、SOD、TNF-α、iNOS、NO、CAT等活性;(2)采用C_(18)色谱柱,磷酸和甲醇为流动相进行梯度洗脱,结合文献报道并通过空白血清与口服TFCPL后的含药血清和对照品之间的HPLC色谱图之间的对比分析,初步推断入血成分。结果:1.(1)CEE中总黄酮含量最高,与其他提取物有显著差异(P0.01,P0.05);(2)CEE对DPPH·(16.31μg/ml)、ABTS~+·(0.240 mg/ml),·OH(0.170 mg/ml),还原力(0.221±0.005)和脂质过氧化(85.84±0.35%)均有明显的清除作用;(3)其含量与抗氧化能力具有显著相关性(P0.01,P0.05)。2.(1)乌榄叶中总黄酮提取最佳条件为:体积分数为50%的乙醇、液料比1:20、回流提取时间1.5 h、提取1次;(2)TFCPL的抗氧化活性(IC_(50)=0.065mg/mL)较维生素C持久性更高。3.(1)乌榄叶黄酮对小鼠体重没有显著性影响(P0.05);与模型组相比,TFCPL组具有不同程度的抑制肝脏的气球性样变,肺部炎性浸润的作用;与模型组比较,各TFCPL组血清中GSH-Px、SOD显著升高(P0.05),MDA、TNF-α、iNOS含量显著性降低(P0.01,P0.05);肝脏中T-AOC、GSH-Px、CAT等抗氧化酶活性明显增强(P0.01,P0.05),NO含量显著降低(P0.05);脑组织中MDA含量显著降低P0.01,P0.05);研究发现乌榄叶中有4种可能是直接吸收入血的成分,提示这几种成分可能发挥药效。结论:1.CEE抗氧化活性最优,总黄酮含量最高。2.纯化后的TFCPL抗氧化能力均大于BHT而且总抗氧化能力大于V_C。3.TFCPL可改善D-半乳糖致氧化损伤小鼠脏器的病理学变化,提高酶活性,其作用机制可能与提高抗氧化酶活力相关。4.推测TFCPL入血成分可能为牡荆素;异牡荆素;金丝桃苷;槲皮素,需进行进一步验证。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图 2-1(A) 乌榄叶提取物清除 DPPH·能力；图 2-1(B) 乌榄叶提取物 DPPH·清除率的 IC50由图 2-1 可知，乌榄叶提取物对 DPPH 清除能力呈明显的浓度依赖性，浓度为 50 μg /mL 时，NE（63.43 ± 0.45）%、EAE（69.04 ± 1.27）%、WE（67.67 ± 0.66）%、CEE（64.43 ± 1.02）% 的清除率相当，其中乌榄叶各提取物的 IC50与 VC 均具有显著性差异(P<0.01, P<0.05)，WE 的 IC50为 16.31，CEE 的 IC50为 17.97，其抗氧化活性相当，约为 VC抗氧化活性的 50%。推测乌榄叶抗氧化能力可能是与DPPH 单电子的配对能力产生的作用。(2)ABTS+ 清除能力测定精密量取乌榄叶提取物溶液（0.05 mg/mL ~0.7 mg/mL）40 μL 后加入 ABTS+ 溶液 4 mL，涡旋 30 s，避光 10 min 后在 734 nm 处测定吸光度 A1。ABTS+ 溶液作空白，吸光度为 A2[92]；ABTS+ 的稀释：用 PBS 溶液稀释 ABTS+ 工作液，在常温下 734nm 处吸光值为 0.7±0.02 即可，对 ABTS+·的清除率按照下式计算：清除率（%） (1 ) 1001AA

图 2-2(A) 乌榄叶提取物清除 ABTS+·能力；图 2-2(B) 乌榄叶提取物 ABTS+·清除率 IC50如图 2-2，CEE（99.35±1.21）%清除能力与 VC（98.84±0.39）%相当，且清除力是 WE 的 1.17 倍，PE 的 18.3 倍。由乌榄叶各提取物和 VC的 IC50值可知，NE、EAE、WE 与 VC具有显著性差异(P<0.01, P<0.05)，但 CEE 与 VC不具有显著性差异(P>0.05)，表明 CEE 与 VC的抗氧化活力相当；提示乌榄叶可能通过有效成分中阴离子结合方式产生抗氧化作用而且 CEE 中含有与 VC相当量的阴离子。(3) ·OH 清除能力测定基于脱氧核糖降解测定法[93]，吸取乌榄叶提取物溶液（0.05 mg/mL ~0.5mg/mL）200μL，依次加入磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.4）600 μL，脱氧核糖（50 mmol/L）100 μL、Na2EDTA（1 mmol/L）100 μL、FeCl3（3.2 mmol/L）100 μL、H2O2（50 mmol/L）100 μL、VC（1.8 mmol/L）100 μL，定容至 1600 μL，50℃温育 20 min，加入三氯乙酸（10 %）500 μL，5 %的 TBA300 μL，在 105 ℃加热 15 min 显色。冷却后在 530 nm 处测定。

乌榄叶提取物在 0.5 mg/ml 时已达到较高清除率，结合图2-3(B)，PE、NE、EAE、WE 与 VC抗·OH 活性具有显著性差异（P<0.05)；EE（IC50=0.176）和 CEE（IC50=0.170）与 VC（IC50=0.168）不具有显著性差异，表明其对·OH清除率相当，其清除能力推测可能通过Fe2+和Cu2+(螯合离子)抑制·OH的产生[94]。2.2.4.2 还原力测定精密量取乌榄叶不同浓度溶液（0.025 ~0.16 mg/mL）0.5mL 与磷酸盐缓冲液（PH=6.6, 0.2 mol/L) 2.5 mL，铁氰化钾（1 %）2.5 mL，混合，50 ℃保温 20 min后，加入三氯乙酸（10 %）2.5 mL，3000 r/min 离心 10 min
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本文编号：2878960