阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿、原发性的神经系统退行性疾病,俗称老年痴呆,主要表现为渐进性语言、记忆障碍;人格改变;认知功能障碍等神经精神症状,严重影响患者的职业生涯、正常社交及生活能力。其特征性病理改变主要有:β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的细胞外老年斑、神经原纤维缠结(NFT)等。“Aβ假说”即由于机体代谢异常,不能被及时清除的Aβ蛋白在脑内特定区域沉积,引起神经元死亡,导致AD。石菖蒲,属天南星科植物,其干燥根茎亦称石菖蒲,味辛性温,具有开窍祛痰、除湿健胃、益智醒神的功效。在临床上常治疗癫痫、老年性痴呆、健忘症、中风失语等疑难杂症。石菖蒲的挥发油提取物在改善小鼠的学习、记忆方面具有显著功效。近年来,在神经系统方面,与石菖蒲相关的研究越来越多,而石菖蒲挥发油对AD治疗作用的研究还较少。本研究用石菖蒲挥发油对AD模型小鼠进行实验研究,观察石菖蒲挥发油对AD模型小鼠神经元损伤的保护作用及可能的机制,为石菖蒲挥发油改善及治疗AD提供实验依据。目的:本实验通过探讨石菖蒲挥发油对AD模型小鼠神经元损伤的保护作用,研究石菖蒲挥发油提取物对AD的改善作用及相关机制探讨。方法:药材为正品的石菖蒲干燥根茎,中草药粉碎机打碎成能过2号筛(20目)粗粉;每个1000 ml的圆底烧瓶中加200 g石菖蒲粗粉、1000 ml水、5粒沸石,静置浸泡1 h,挥发油测定仪器提取,至石菖蒲挥发油不再增多,关闭加热套电源,停止加热。昆明小鼠随机分为正常组(空白对照组)、手术对照组、模型组(Aβ组)、治疗组,其中治疗组又分为治疗组I Aβ+2.5μL石菖蒲挥发油/10 g b.w.和治疗组II Aβ+5μL石菖蒲挥发油/10 g b.w.两组。用脑立体定位仪,向模型组和治疗组小鼠大脑的双侧海马区,微量注射寡聚态Aβ_(1-42),建造AD小鼠模型;相同方法,手术对照组微量注射等量的生理盐水,正常组不做处理。造模七天后,新颖物体识别实验筛选出认知和记忆功能障碍的造模成功小鼠,之后治疗组开始灌胃给药,治疗组I、II灌胃剂量分别为:2.5μL石菖蒲挥发油/10 g b.w.和5μL石菖蒲挥发油/10 g b.w.,手术对照组、模型组灌胃相同量生理盐水,连续灌胃三周;再次做新颖物体识别实验,行为学分析给药石菖蒲挥发油对各组小鼠的记忆和认知功能的影响。HE染色,观察各组海马区细胞形态变化。免疫组织化学(IHC)法,检测不同组小鼠海马内Aβ的沉积以及DCX、Nestin、BDNF、TrkB、NT3的表达。Western blot,检测Nestin、DCX、BDNF、NT3、TrkB的表达。结果:1、新颖物体识别实验结果表明,正常组和手术对照组小鼠的认知指数无显著差异(P0.05),而模型组小鼠的认知指数明显下降(P0.01),表明其认知功能明显衰减;与模型组相比,治疗组小鼠的认知指数显著增加(P0.05),提示治疗组小鼠的认知功能有所改善。2、HE染色结果表明,与正常组相比,手术对照组小鼠大脑海马区细胞并无严重损伤,仅针道附近细胞排列紊乱;与正常组和手术对照组相比,模型组小鼠大脑海马区损伤严重,海马齿状回细胞形态改变,主要表现:神经元胞核深染、胞核固缩,细胞排列疏松紊乱,且细胞胞体与周围组织脱离;以AD模型组为对照,治疗组有所改善。3、免疫组织化学结果表明,正常组和手术对照组小鼠大脑海马区几乎检测不到Aβ沉积;模型组海马区有大量Aβ斑块沉积;与模型组相比,治疗组小鼠大脑海马区Aβ斑块沉积含量明显降低。4、DCX、Nestin的免疫组织化学和Western blot结果表明,与正常组相比,手术对照组小鼠大脑中DCX、Nestin阳性细胞表达量无显著性差异(P0.05);而模型组小鼠大脑中DCX、Nestin的阳性细胞表达量明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,治疗组小鼠大脑中二者的阳性细胞数量明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。5、BDNF、TrkB的免疫组织化学和Western blot结果表明,手术对照组和正常组小鼠大脑中BDNF、TrkB的阳性细胞表达量无显著性差异(P0.05);模型组大脑中BDNF、TrkB的阳性细胞表达量与正常组相比明显降低,统计学分析具有差异性(P0.05);以模型组为对照,治疗组小鼠大脑中二者阳性细胞表达量都明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。各组中,BDNF、TrkB阳性细胞表达量的趋势是一致的。6、NT3的免疫组织化学和Western blot结果表明,与正常组相比,手术对照组小鼠大脑中NT3的含量无显著性差异(P0.05);而模型组小鼠大脑中NT3阳性细胞表达量明显减少,统计学结果具有显著性差异(P0.001);以模型组为对照,治疗组小鼠大脑中NT3的表达量显著增加,结果具有统计学意义(P0.01)。结论:1、海马区微量注射Aβ_(1-42)可诱导小鼠大脑出现一系列类AD相关的病理变化及认知功能障碍。2、石菖蒲挥发油可能改善AD模型小鼠的认知功能。3、石菖蒲挥发油治疗后,DCX、Nestin阳性表达的细胞数目明显增加,提示石菖蒲挥发油可能诱导小鼠海马神经元的再生;其可能通过上调BDNF、TrkB、NT3表达,促进和保护小鼠海马神经元的生长。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5;R-332
【部分图文】：
提取（参考 2015 版中国药根茎使其能通过二号筛，混-1 所示，A 为硬质的圆底烧1 ml 刻度）、冷凝回流管 C。仪器都应该是清洗干净且干止挥发油挥发出来。，提取石菖蒲挥发油采用此在 1.0 以下的挥发油，称取石水适量，玻璃珠数粒，防止水使充满挥发油测定器的整电热套中加热至沸腾，并保闭电源停止加热，放置自然 0 刻度线上 5 mm 时关闭活度，计算石菖蒲挥发油的含
台盼蓝的小鼠大脑进行切片，确定实验造 AD 模型右旁开 1.5 mm，进针 2.3 mm。提前准备好实验所需仪器及试剂，调试固定脑平头微量注射器以及颅骨钻等仪器，设置微量注射醉小鼠，腹腔注射，剂量为 0.015 ml/g 体重。麻醉小鼠颅骨保持水平，剔除小鼠头顶的鼠毛，用棉花明小鼠头顶沿正中矢状方向划开一道长约 1.5 cm 的钻在小鼠大脑前囟后 2.3 mm，左右旁开 1.5 mm，示）轻缓打孔，使用平头微量注射器向小鼠海马内侧海马注射（如图 2-3 B 所示）。注射时，平头微量注注射时间 2 min，留针 5 min，保证药液完全浸入，再停顿留针 4 min，待 Aβ1-42工作液在小鼠海马内针至平头微量注射器全部拔出。在针孔处涂抹青霉把伤口皮肤缝合，再次涂抹青霉素钠干粉消炎，最连续注射 3 天，防止小鼠术后发炎感染。
图 2-3 脑立体定位仪微量注射 Aβ1-42Fig. 2-3 Microinjection ofAβ1-42by stereotaxis2.2.4 新颖物体识别实验建造模型后第七天和灌胃石菖蒲挥发油3周以后分别进行行为学新颖物体识别实验。相对于熟悉的物体，小鼠对陌生的新颖物体具有更强的好奇心，相应的探索时间就会越长。一个纸质的测试敞箱、2 套不同的测试物体（相似的小鼠喜好程度，每套两个相同物体）组成了本实验的装置。测试敞箱为 0.6 m × 0.6 m × 0.6 m 的纸箱，底面平铺一层小鼠垫料；A、B 两套测试物体的颜色、材质均不同，高度约为 10cm，均需有一定的重量，防止被小鼠移动。该实验包括适应期、熟悉期、测试期三个阶段，整个实验过程应保持灯光微暗且环境安静，防止小鼠的自主行为受到干扰。为避免实验过程中小鼠的气味等信号会影响下一只小鼠的行为，每只小鼠测试完成后均应对测试敞箱的垫料进行更换。适应期：将小鼠放置于测试敞箱的正中，除底面平铺一层垫料外不放其他任何物
【参考文献】
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1 陈双庆;黄敏;刘晨鹭;沈玉英;蔡庆;王培军;;Wnt/β-连环素与细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号通路介导脑源性神经营养因子促进诱导多能干细胞分化为神经干细胞的研究[J];中华医学杂志;2017年41期
2 曾维军;周文胜;王佳;;神经营养因子和生长因子在神经干细胞中的研究进展[J];临床与病理杂志;2015年03期
3 付学军;黄巧英;徐铅辉;邹良玉;张睿;褚晓凡;;持续脑缺血后半暗带区星形胶质细胞的转归[J];华中科技大学学报(医学版);2014年05期
4 闫娟娟;刘明;胡园;余冰颖;张刚强;刘屏;;定志小丸对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的影响及机制[J];中国中药杂志;2012年21期
5 李清山;杨威;潘艳芳;闵婕;张喆;高慧中;祁金顺;;脑源性神经营养因子拮抗β淀粉样蛋白所致大鼠在体海马长时程增强的伤害[J];中国应用生理学杂志;2012年05期
6 匡忠生;江湧;李志强;王淑英;谢宇晖;;石菖蒲提取成分对大鼠脑皮质NMDA、M受体与其配体结合的影响[J];中药新药与临床药理;2010年04期
7 江湧;方永奇;李小兵;李翎;蒋红兰;;β-细辛醚对AD大鼠海马神经元蛋白质组图谱的影响[J];现代生物医学进展;2007年09期
8 李福胜;王静;何明大;;脑源性神经营养因子对阿尔茨海默病的作用[J];实用预防医学;2007年04期
9 江湧;何玉萍;邹衍衍;方永奇;;β-细辛醚对痴呆小鼠皮质神经元细胞内钙离子浓度的影响[J];中国康复医学杂志;2007年06期
10 方永奇,李翎,吴启端,邹衍衍,魏刚,林双锋;β-细辛醚和冰片对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用[J];中国中医药科技;2004年06期
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2882830
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