重楼皂苷Ⅶ抑制结肠癌细胞迁移和侵袭作用及机制研究

发布时间：2020-11-15 14:08

　　 研究背景:结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,全球发病率和病死率分别在第三位和第四位。侵袭和转移是导致肿瘤患者死亡的重要原因。有效的抑制结肠癌转移是提高结肠癌患者生存率的重要措施。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT),是上皮细胞来源的恶性肿瘤早期获得迁移和侵袭能力的关键机制。重楼皂苷Ⅶ是重楼的有效成分之一,课题组前期研究发现重楼对肺癌的增殖和转移有显著的抑制作用,但其机制尚不明确。重楼皂苷Ⅶ对结肠癌侵袭和转移的作用及机制尚未见报道。本课题以人结肠癌细胞为研究对象,首次从细胞和动物水平研究重楼皂苷Ⅶ对结肠癌细胞迁移和侵袭的作用,并初步探讨重楼皂苷Ⅶ是否通过抑制其EMT机制发挥作用。目的:本课题从细胞和在体水平研究重楼皂苷Ⅶ对人结肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用,初步探讨其可能的作用机制。方法:通过MTT法筛选重楼皂苷Ⅶ对结肠癌HCT116和SW620细胞的半数抑制浓度;划痕实验和Transwell迁移实验观察重楼皂苷Ⅶ对细胞迁移能力的影响;Transwell侵袭实验观察重楼皂苷Ⅶ对细胞侵袭能力的影响。Western Blot检测重楼皂苷Ⅶ对细胞EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug、Twist表达的影响;扫描电镜观察重楼皂苷Ⅶ对细胞形态变化的影响。肝脏是结肠癌最常见的转移靶器官,故本实验采用经脾脏注射结肠癌细胞建立实验性裸鼠结肠癌肝转移模型,实验期内观察裸鼠一般状态。造模术后第30天,利用IVIS小动物活体成像系统对造模裸鼠体内荧光强度进行检测,观察裸鼠体内结肠癌肝转移情况及重楼皂苷Ⅶ的作用。造模术后第31天,麻醉处死裸鼠,取出裸鼠肝脏,观察各组裸鼠肝脏表面转移成瘤情况及给药干预后结肠癌肝转移抑制率。制备转移瘤病理切片,HE染色观察重楼皂苷Ⅶ对结肠癌细胞的病理形态影响。Western Blot检测重楼皂苷Ⅶ对结肠癌肝转移瘤的上皮间质转化(EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug、Twist表达的影响。结果:MTT结果表明,重楼皂苷Ⅶ对HCT116和SW620细胞的增殖具有一定的抑制作用,重楼皂苷Ⅶ对HCT116细胞半数抑制浓度IC50值为(3.72±0.09)μM,对SW620细胞半数抑制浓度IC50值为(3.46±0.13)μM。划痕实验结果表明,与对照组相比,重楼皂苷Ⅶ 0.5μM、1.0μM、2.0μM组的迁移距离明显缩短,提示细胞迁移能力明显降低,差异有统计学意义(P0.05或者P0.01),重楼皂苷Ⅶ2.0μM组尤为明显,其作用呈剂量依赖性。Transwell迁移实验和侵袭实验结果表明,与对照组相比,重楼皂苷Ⅶ剂量依赖性抑制细胞迁移和侵袭作用(P0.01)。Western Blot检测结果表明,与对照组相比,重楼皂苷Ⅶ 0.5μM、1.0μM、2.0μM组上皮样标志蛋白E-cadherin表达明显升高,间质样标志蛋白N-cadherin和EMT相关转录因子Snail、Slug、Twist表达明显降低,表明重楼皂苷Ⅶ抑制了细胞的EMT。扫描电镜结果表明,与对照组相比,重楼皂苷Ⅶ 0.5μM、1.0μM、2.0μM组的细胞均由多角伸展形、梭形转变成圆形,伪足长度变短、数量减少,细胞间连结松散、间隙增大,且剂量越大影响越显著,提示重楼皂苷Ⅶ抑制了细胞的上皮间质转化形态学改变。经脾脏注射法建立实验性裸鼠结肠癌肝转移模型术后第30天,活体成像检测结果发现,裸鼠肝脏区检测到阳性信号在模型对照组为100%,5.0 mg/kg 5-FU、2.5 mg/kg重楼皂苷Ⅶ和5.0 mg/kg重楼皂苷Ⅶ治疗组分别为60%、40%和20%。提示肿瘤接种早期即开始应用5-FU及重楼皂苷Ⅶ可抑制HCT116细胞向肝脏的转移,且较大剂量重楼皂苷Ⅶ抑制效果优于阳性对照5-FU。造模术后第31天,麻醉处死裸鼠并取出肝脏,发生肝转移的裸鼠肝脏肉眼可见白色或灰黄色转移瘤,多见于肝脏边缘,肝转移发生率同活体成像结果。结肠癌肝转移瘤病理切片各组镜下均可见大量肿瘤细胞,异型性明显,5-FU和重楼皂苷Ⅶ均引起肿瘤组织中央区域不同程度坏死,其中5.0 mg/kg重楼皂苷Ⅶ治疗组肿瘤组织内坏死程度最为严重,可见大片状凝固性坏死。Western Blot检测结果表明,与模型对照组相比,2.5 mg/kg重楼皂苷Ⅶ和5.0 mg/kg重楼皂苷Ⅶ治疗组上皮样标志蛋白E-cadherin表达明显升高,间质样标志蛋白N-cadherin及EMT相关转录因子Snail、Slug、Twist表达明显降低,提示重楼皂苷Ⅶ通过抑制结肠癌细胞EMT而抑制其转移。结论:重楼皂苷Ⅶ在体外、体内实验中对人结肠癌细胞迁移和侵袭均有抑制作用,其作用机制可能是通过抑制结肠癌细胞上皮间质转化。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：

图 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ结构式及分子式3. 重楼皂苷的抗肿瘤作用机制近年来许多学者对重楼皂苷的生物活性及其作用机制进行了深入研究和探索，发现重楼皂苷具有多种抗肿瘤功效，例如诱导肿瘤细胞凋亡，调节机体免疫功能，抑制肿瘤血管生长以及逆转肿瘤细胞耐药等。3.1 诱导肿瘤细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）是一种基本的生物现象，在维持生物体内环境稳定，促进系统器官生长发育，甚至在生物体的进化过程中均可发挥重要作用。对于多细胞生物体来说，细胞的增殖和凋亡始终保持着动态平衡，而对于肿瘤细胞来说，其细胞凋亡过程受到了一定程度的抑制，但是肿瘤细胞的增殖过程却未受影响，因此细胞内环境稳态被打破，系统器官的生长和发育出现异常。诱导细胞凋亡成为了肿瘤研

空军军医大学硕士学位论文2.8 统计学方法SPSS 19.0 对结果进行分析，计量资料采用均数±标准差（ x ±s）表示，组间比较采用 t 检验， P＜0.05 为差异有统计学意义。3 结果3.1 重楼皂苷 VII 抑制 HCT116 和 SW620 细胞的增殖结果表明，重楼皂苷 VII 对HCT116和SW620细胞的增殖具有一定的抑制作用，经 GraphPad Prism7.0 计算，重楼皂苷 VII 对 HCT116 细胞（A）半数抑制浓度 IC50值为（3.72 ±0.09）μM，对 SW620 细胞（B）半数抑制浓度 IC50 值为（3.46 ±0.13）μM。差异有统计学意义（P＜0.01）。如图 2-1 所示。

38图 2-2 划痕实验观察重楼皂苷Ⅶ对 HCT116 和 SW620 细胞迁移能力的影响A）HCT116 细胞各组划痕 24h 后愈合情况；（B）HCT116 细胞各组划痕 24h移距离及统计结果；（C）SW620 细胞各组划痕 24h 后愈合情况；（D）SW6胞各组划痕 24h 后迁移距离及统计结果(100×)。数据以 x ±s 表示，n=3，*P<0s. Control，**P<0.01 vs. Control。
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本文编号：2884839