MyD88基因在实验性病毒性爆发性肝炎中的作用研究

发布时间：2020-11-16 08:27

　　 目的病毒性爆发性肝炎(Viral fulminant hepatitis,简称FH)是一种严重的肝脏疾病,由于肝脏组织炎症反应过度,死亡率较高。对FH疾病中的炎症信号通路缺乏认识严重阻碍了临床疾病干预措施的实施。髓系分化原反应基因88(MyD88)是大多数TLR、IL-1R和IL-18R依赖性炎症信号通路的关键受体蛋白,在介导宿主对病原菌入侵的原反应中发挥重要作用。这种信号通路的过度激活会加剧某些疾病,而这些疾病在本质上是致命的。但MyD88信号通路是否及如何参与病毒性爆发性肝炎(viral fulminant hepatitis,FH)的发病机制尚不清楚。本研究旨在通过揭示MyD88介导的信号通路与病毒性爆发性肝炎的关系,为FH疾病的治疗策略提供新的线索和实验依据。方法构建小鼠病毒性爆发性肝炎模型,监测C57BL/6、Rag-1~(-/-)、Trif~(-/-)、Myd88~(-/-)小鼠20天内的存活情况;感染MHV3病毒0h、48h和72h后,收集MyD88~(-/-)和WT小鼠的肝脏组织,用HE染色检测两组小鼠肝脏损伤差异;用Tunel技术检测小鼠肝细胞凋亡情况;采用Western-Blot检测感染48h和72h后小鼠肝脏内MHV-3受体Bgp-1的表达情况;采用斑块法分析感染72h后肝脏病毒滴度。感染MHV3病毒0h、24h、48h和72h后,收集MyD88~(-/-)和WT小鼠的肝脏组织,用RT-qPCR、Western-Blot、ELISA检测FGL2的mRNA和蛋白表达水平;免疫组化检测FGL2和Fibrinogen的表达情况。监测FGL2~(-/-)和C57BL/6小鼠感染MHV3病毒20天内的生存差异。用RT-qPCR、Western-Blot、免疫组化检测小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-6和proIL-1β的mRNA和蛋白表达水平;监测TNF-α~(-/-)、IL-1R~(-/-)和C57BL/6小鼠感染MHV3病毒20天内的生存差异。相同周龄的C57BL/6(WT)和MyD88~(-/-)小鼠感染MHV-3(100 PFU)后,从感染的肝脏中分离细胞,用流式细胞术检测肝脏中Lin~-Thy1.2~+ILCs浸润情况;用统计学分析肝脏中Lin~-Thy1.2~+ILCs和NKp46~-Lin~-Thy1.2~+Roγt~+ILC3浸润情况;NKp46~-Lin~-Thy1.2~+Roγt~+ILC3细胞分泌的IL-17、TNF-α和IL-1β用流式进行检测。巨噬细胞系Raw264.7细胞经MHV-3感染(MOI=1),免疫荧光共聚焦显微镜监测未感染或感染24h后HMGB1定位;ELISA检测细胞上清液中HMGB1的浓度。相同周龄的C57BL/6(WT)和MyD88~(-/-)小鼠感染MHV-3(100 PFU)后,分别在不同时间点提取肝组织,用免疫组化和免疫荧光检测HMGB1蛋白在正常和感染MHV-3的肝组织中表达情况;用ELISA检测MyD88~(-/-)和WT小鼠血清中HMGB1的浓度,N=5/组;用Western-Blot检测MyD88~(-/-)和WT小鼠肝脏中HMGB1蛋白水平,N=4/组。结果与WT小鼠相比,MyD88~(-/-)小鼠的生存周期明显延长(P0.001)。HE和Tunel结果显示MyD88~(-/-)小鼠的肝组织损伤和肝细胞凋亡情况明显减轻。Western-Blot显示MyD88~(-/-)小鼠的MHV3受体Bgp-1蛋白表达明显降低。斑块法分析感染MHV3病毒72h后MyD88~(-/-)小鼠肝脏病毒滴度显著下降(P0.05)。RT-qPCR、Western-Blot、ELISA检测显示MyD88~(-/-)小鼠肝脏中fgl2的mRNA和蛋白表达水平明显降低,尤其是在72h差异最为明显(P0.05)。免疫组化显示相比WT小鼠,MyD88~(-/-)小鼠的fgl2和fibrinogen表达显著下降。相比C57BL/6小鼠,fgl2~(-/-)小鼠的生存周期明显延长(P0.001)。RT-qPCR、Western-Blot和免疫组化检测结果显示MyD88~(-/-)小鼠肝脏中IFN-γ、TNF-α、IL-6和proIL-1β的表达显著下降(P0.05)。相比C57BL/6小鼠,TNF-α~(-/-)和IL-1R1~(-/-)小鼠的生存期显著延长(P0.05)。流式细胞仪检测显示,在感染MHV3病毒24h和48h后,WT肝脏中浸润的ILCs(Lin~-Thy1.2~+)明显高于MyD88~(-/-)小鼠(P0.05)。此外,统计分析表明,MyD88~(-/-)小鼠感染MHV-3后,肝脏组织中的NKp46~-Lin~-Thy1.2~+Roγt~+第三组固有淋巴细胞(ILC3)显著减少。而这些ILC3有能力产生促炎介质,如proIL-1β,TNF-α和IL-17等。巨噬细胞系Raw264.7细胞未感染时,免疫荧光共聚焦显微镜显示HMGB1分布在细胞核内。而当细胞感染MHV-3(MOI=1)后,HMGB1定位于细胞的细胞核和细胞质内。而且,感染72h后,上清液中积累的HMGB1浓度也随时间逐渐增加。在感染MHV3病毒的小鼠肝脏内,发现了同样的现象,HMGB1从细胞核迁移到胞质内,并且相比WT小鼠,MyD88~(-/-)小鼠血清和肝脏中的HMGB1显著下调(P0.05)。结论成功构建了病毒性爆发性肝炎模型,阐明了MyD88~(-/-)小鼠可以通过减少肝脏中HMGB1的分泌,进而减弱促炎反应;可以通过减少肝脏中NKp46~-Lin~-Thy1.2~+Roγt~+第三组固有淋巴细胞(ILC3)的浸润,减少多种促炎细胞因子的分泌,进而减轻肝脏组织的病变和损伤情况,延长感染爆发性肝炎小鼠的生存周期。综上结果所述,MyD88基因会加重实验性病毒性重型肝炎的免疫病理。我们可以通过适当调节MyD88信号通路,并结合阻断其他炎症因子,来达到治疗人类病毒性FH等严重炎症疾病的目的。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

结果结果MyD88-/-小鼠感染后肝组织损伤和死亡率变化情况小鼠病毒性爆发性肝炎（FH）模型的构建从液氮罐中取出冻存的 MHV-3 病毒(1×107PFU/mL)，放于冰上融化。用无理盐水稀释病毒滴度至 1PFU/ul。之后往 12 周龄的 C57BL/6 野生型小鼠的注射 100ul 的 MHV-3 病毒(100PFU/只)，感染 0h，48h，72h 后收集小鼠的织，检测小鼠的肝组织损伤情况等指标。如图 1 所示，小鼠肝组织损伤严感染 72h 后病毒滴度很高，实验性病毒性爆发性肝炎（FH）小鼠模型建模

测小鼠 20 天内的存活率。相同周龄的 C57BL/6 (WT)和 MyD88-/-小鼠感染 MHV-3 (1对存活率进行了总共 20 天的监测。重复了三次，结果都相似，P < 0.05 即认为具有异。 Monitoring survival rate of mice within 20 days. Age matched C57BL/6 (WT) nic MyD88-/-mice were infected with MHV-3(100 PFU) , (A) the survival rate wored for a total of 20 days. One representative of three experiments with sim is shown. *P < 0.05.了评估先天免疫和适应性免疫反应在重症病毒性肝炎中的作用,相同周龄的L/6 (WT, n = 10), Rag-1-/-(n = 6), MyD88-/-(n = 11) 和 Trif-/-(n = 5) 小鼠腹腔注U 的 MHV-3 病毒，随后监测这些小鼠的死亡率。令人惊讶的是，我们发现Rag1-/-和 Trif-/-小鼠在感染后 8 天内全部死亡，而 MyD88-/-组中超过 72.7% 的小鼠在感染 20 天后仍然存活(图 2)。结果显示，这些结果表明，MyD88 Trif 基因缺失更能显著降低 MHV-3 诱导的发病率和死亡率，而且适应性1 缺乏)在发病机制中并不起主要作用。组织损伤以及肝细胞凋亡情况检测

图 3 肝组织损伤以及肝细胞凋亡情况。相同周龄的 C57BL/6 (WT) 和 MyD88-/-小鼠感染MHV-3 (100 PFU)，在不同时间点，从感染病毒的 WT 和 MyD88-/-小鼠中分离肝组织，(A)用H&E 染色进行肝组织形态学分析，(B)用 TUNEL 染色分析细胞的凋亡情况。比例尺= 20μm。Fig 3. Age matched C57BL/6 (WT) and congenic MyD88-/-mice were infected withMHV-3 (100 PFU), liver tissues were isolated from virus infected WT and congenicMyD88-/-mice at different time points, (A) the morphology was analyzed by H&Estaining, (B) cells undergoing apoptosis was analyzed by TUNEL staining. Scale bar=20μm.相同周龄的 C57BL/6 (WT) 和 MyD88-/-小鼠感染 MHV-3 (100 PFU)，在感染后的 0h、48h 和 72h，取小鼠的肝脏组织，进行 HE 检测。HE 染色显示(图 3A)，感染 MHV-3 病毒 48h 和 72h 后，WT 小鼠肝脏出现严重坏死并伴有稀疏的多形核白细胞浸润。而 MyD88-/-肝脏形态在 48h 基本正常，坏死面积在 72h 也明显减少。小鼠注射 MHV-3 病毒 0h、48h 和 72 后，取小鼠的肝脏组织，用 TUNEL 试剂盒检测肝细胞的凋亡情况(图 3B)。和 HE 结果相吻合，WT 小鼠的肝细胞凋亡数量要明显多于 MyD88-/-小鼠。尤其是在感染 MHV-3 病毒 72h 后，两组之间的差异更
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本文编号：2885849