甲基莲心碱对对乙酰氨基酚所致肝损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-11-16 14:45

　　 背景:药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是指在药物使用过程中,因药物本身或其代谢产物或药物引发的过敏反应所导致的肝脏损伤,亦称药物性肝病(drug-induced liver disease,DILD)。临床上可表现为各种急慢性肝病,重者可能危及生命,需积极抢救治疗。作为一种临床上广泛应用的解热镇痛药,对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)所造成的急性肝损伤占据了药物性肝损伤相当大的比例,目前APAP过量使用和滥用引起的严重肝毒性问题已日益引起人们的关注。APAP诱导的肝损伤机制非常复杂,许多细胞内和细胞外事件都参与其病理生理过程,包括APAP代谢,线粒体氧化应激,内质网应激,自噬,无菌性炎症,微循环功能障碍和肝再生。甲基莲心碱(neferine,Nef)是天然药物莲子心的非水溶性总碱提取物,属双苄基异喹啉生物碱,具有抗炎抗氧化、抗纤维化、扩血管降血压、抑制血小板聚集、抗心率失常以及抗肿瘤等多重作用。基于前期研究,我们发现甲基莲心碱对肝纤维化大鼠肝脏具有保护作用,然而,Nef干预是否对APAP致肝损伤有保护作用,尚无相关研究。因此本课题旨在探讨Nef是否在APAP肝损伤中发挥作用并研究其作用的相关机制。方法:(1)APAP致死剂量实验C57BL/6雄性小鼠40只,随机分为以下4组:(1)APAP+NS组,NS灌胃0.4ml,每日一次,n=10;(2)APAP+Nef(5)组,Nef混悬液5mg/kg灌胃0.4ml,每日一次,n=10;(3)APAP+Nef(10)组,Nef混悬液10mg/kg灌胃0.4ml,每日一次,n=10;(4)APAP+Nef(20)组,Nef混悬液20mg/kg灌胃0.4ml,每日一次,n=10。对各组小鼠连续灌胃Nef混悬液14天,末次灌胃0.5小时后,各组小鼠腹腔注射2.5%的APAP溶液600mg/kg。(2)APAP亚致死剂量下实验C57BL/6雄性小鼠30只,随机分为以下5组:(1)生理盐水对照组(NS control):NS灌胃0.4ml,每日一次,n=6;(2)APAP+NS组,NS灌胃0.4ml,每日一次,n=6;(3)APAP+Nef(5)组,Nef混悬液5mg/kg灌胃0.4ml,每日一次,n=6;(4)APAP+Nef(10)组,Nef混悬液10mg/kg灌胃0.4ml,每日一次,n=6;(5)APAP+Nef(20)组,Nef混悬液20mg/kg灌胃0.4ml,每日一次,n=6。对小鼠连续灌胃Nef混悬液14天,末次灌胃0.5小时后,除NS control组外,其余各组小鼠腹腔注射2.5%的APAP溶液400mg/kg。结果:(1)Nef提高APAP致肝损伤小鼠5天生存率,APAP+Nef(20)组小鼠5天存活率高于APAP+NS组,差异有统计学意义(P0.05)。(2)Nef降低APAP致肝损伤小鼠血清转氨酶水平,与APAP+NS组相比,APAP+Nef(10)组和APAP+Nef(20)组ALT和AST水平降低,且APAP+Nef(20)组低于APAP+Nef(10)组,差异有统计学意义(P0.05)。(3)Nef减轻APAP致肝损伤小鼠组织病理改变,HE染色结果显示与APAP+NS组相比,APAP+Nef(10)组和APAP+Nef(20)组的肝小叶坏死、脂肪浸润及淋巴细胞浸润程度明显减轻,并且在APAP+Nef(20)组,上述各项改善比APAP+Nef(10)组更明显,组织学评分结果差异有统计学意义(P0.05)。(4)Nef抑制APAP致肝损伤小鼠炎症因子的表达,与APAP+NS组相比,APAP+Nef(10)组和APAP+Nef(20)组TNF-α、IL-6表达降低,且APAP+Nef(20)组低于APAP+Nef(10)组,差异有统计学意义(P0.05)。(5)Nef抑制APAP致肝损伤小鼠肝细胞凋亡,与APAP+NS组相比,APAP+Nef(10)组和APAP+Nef(20)组肝细胞凋亡比例降低,且APAP+Nef(20)组低于APAP+Nef(10)组,凋亡细胞百分比结果差异有统计学意义(P0.05)。(6)Nef降低APAP致肝损伤小鼠氧化应激水平,Nef可以减少机体ROS的产生,差异有统计学意义(P0.05);Nef减轻了MDA对机体细胞的损伤,差异有统计学意义(P0.05);Nef提高了机体的抗氧自由基的能力,SOD、GSH、GSH-px的表达水平升高,差异有统计学意义(P0.05)。(7)Nef可以上调Nrf2/HO-1/NQO1通路蛋白表达,与APAP+NS组相比,APAP+Nef(10)组和APAP+Nef(20)组Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表达量均升高,而且APAP+Nef(20)组相比APAP+Nef(10)组蛋白表达升高的更明显,差异有统计学意义(P0.05)。结论:研究结果表明Nef在APAP诱导的肝脏毒性损伤中起到了预防和治疗的作用,这可能主要因为Nef强大的抗氧化能力,阻断ROS进程,抑制氧化应激和脂质过氧化,上调Nrf2/HO-1/NQO1抗氧化通路蛋白的表达、减轻肝细胞坏死、减轻炎症因子表达,从而发挥Nef对对乙酰氨基酚所致肝损伤的保护作用。本研究可为APAP肝损伤的治疗提供新的策略,为Nef在APAP诱导的肝损伤中的应用提供理论基础。
【学位单位】：陕西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

药物性肝损伤的机制示意图

图 1-2 药物与 HLA 分子相互作用导致适应性免疫反应（Kullak-Ublick et al.Gut, 2017, 66(6): 1154-64.）1.3 中医对药物性肝损伤的认识药物性肝损伤归属于中医学“胁痛”“黄疸”“积聚”“药物毒”等范畴。在大量应用天然药物的经验积累中，中医在临床实践中积累了丰富的药物性损伤的经验，并提出了应对损伤的方法。《说文》有云：毒，厚也，害人之草，往往而生。其意本为草中某些对人体有害的化学成份。而《广韵·沃韵》中又作引申：毒者，害也。从文字上的梳理不难得出先民对“毒”字的引证与理解。自此毒由本意扩展为一切对人体有害之物。《尚书》中“药不瞑眩，厥剂弗廖”的记述，反映了我国先民对天然药物毒性反应与安全剂量的认识与记录。而在中医四大经典名著《金匮要略》中，仲景锦心素手的于全书最后另附一章专篇讨论误食毒性食物、药物后的解救方法。在方剂的配伍应用上，高明医家常配伍佐、使之药，用来减轻某些药物的毒副作用。药物本为救人所用，但是当剂量超出病患所能承受的范围时则往往出现中医所谓的“瞑眩反应”。因天然药物各有

图2-1 APAP代谢及影响其毒性的潜在因素(Bunchorntavakul, C. et.al. Clinics in Liver Disease, 2013. 17(4): p. 587-607)2.2 对乙酰氨基酚的发病机制关于 APAP 肝毒性的机制研究始于 1973 年，Mitchell 等人发现 APAP 在肝细胞内被代谢为一种物质，该物质能够消耗 GSH 并可与细胞内其他重要蛋白共价结合进而造成细胞损伤，这种物质后来被人们鉴定出来即为 N-乙酰-对-苯醌亚胺 NAPQI[25]。同时随着对细胞色素氧化酶(P450)研究的不断深入，人们发现 P450 活化的过程有大量活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)的大量释放，于是有学者提出可能是 APAP 代谢过程中产生的大量 ROS 和 RNS 造成了脂质过氧化而引发了细胞损伤。近年来，炎性因子、多种信号通路的激活等更多的机制被提出[24]，现作一简单的归纳总结（图 2-2）。
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本文编号：2886354