中药车前子及其活性成分对鼠伤寒沙门氏菌的治疗作用及机制研究

发布时间：2020-11-17 10:26

　　目的:通过中药车前子及其活性成分对鼠伤寒沙门氏菌的动物保护实验,研究其对鼠伤寒沙门氏菌的治疗作用,并运用分子生物学方法及细胞学方法,进一步探讨中药车前子及其活性成分对鼠伤寒沙门氏菌治疗作用及作用机制。方法:1、选取普通级昆明雄性小鼠80只分为两组,两组给予不同菌量的沙门氏菌,观察小鼠死亡率、小鼠生长情况、盲肠病理变化,探讨车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌小鼠模型的保护作用;2、通过液相色谱仪,测定车前子提取物中主要活性成分京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、桃叶珊瑚苷含量,采用NCCLS推荐的肉汤微量稀释法测定中药车前子及其活性成分对鼠伤寒沙门氏菌的最低抑菌浓度,通过记录菌液的OD_(600)数值,监测鼠伤寒沙门氏菌感染的生长情况,绘制生长曲线。3、通过计算车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌入侵Hela细胞的入侵率,以验证其对鼠伤寒沙门氏菌入侵宿主细胞的抑制作用,通过测量酶标仪测量490nm处的吸光值,计算样品上清中LDH的释放量,验证车前子提取物对Hela细胞的毒性。4、通过Western-Blot方法,观察车前子及其活性成分京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、桃叶珊瑚苷对鼠伤寒沙门氏菌SPI-1主要效应蛋白SipA及SipC表达的影响,进一步分析车前子及主要活性成分桃叶珊瑚苷对鼠伤沙门氏菌治疗的作用机制。结果:1、车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的死亡率、体重下降具有很好的保护作用。小鼠盲肠病理切片显示,鼠伤寒沙门氏菌处理组小鼠盲肠杯状细胞减少甚至消失,结构破坏,大量中性粒细胞浸润,而药物治疗组及inva敲除组,小鼠的盲肠仅有不明显的皮下水肿,且杯状细胞排列整齐,结构完整,表明车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌在小鼠盲肠中引起的病理变化具有显著的保护作用。2、经高效液相仪测定车前子提取物主要活性成分中京尼平苷酸的含量为0.76%,毛蕊花糖苷的含量为0.51%、桃叶珊瑚苷的含量为0.04%。车前子提取物、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、桃叶珊瑚苷在常规有效药物浓度下对鼠伤寒沙门氏菌的生长均无抑制作用。3、车前子提取物在有效药物浓度16,32mg/mL时,在不影响Hela细胞的活性同时,可有效抑制沙门氏菌对Hela细胞的入侵,仅在浓度为128mg/mL时表现出微弱的细胞毒性。实验表明,车前子提取物可有效抑制鼠伤寒沙门氏菌入侵上皮细胞,干预细胞感染过程。4、车前子提取物未有效抑制鼠伤寒沙门氏菌重要入侵蛋白SipA的表达水平,但车前子及主要活性成分桃叶珊瑚苷可以有效抑制鼠伤寒沙门氏菌重要效应蛋白SipC的表达水平。进一步证实车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌的保护作用机制为车前子提取物对效应蛋白SipC的下调作用,其主要起效成分为活性成分桃叶珊瑚苷。结论:车前子及其活性成分桃叶珊瑚苷,通过对鼠伤寒SPI-1编码的重要效应蛋白SipC显著下调作用,致使SPI-1编码的效应蛋白不能正常的运转,鼠伤寒沙门氏菌入侵上皮细胞的能力因此而被削弱,进而起到了抑制鼠伤寒沙门氏菌对上皮细胞入侵的作用,保护感染小鼠的作用。车前子及其活性成分对鼠伤寒沙门氏菌的治疗作用的得到了进一步证实,其作用机理及起效成分得到进一步明确。根据中医渗湿止泻理论,选取中药车前子治疗鼠伤寒沙门氏菌,通过实验对其治疗效果及机制进一步明确,为中医药治疗鼠伤寒沙门氏感染提供了理论与实验依据,扩展了新思路。
【学位单位】：长春中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

车前子,鼠伤寒沙门氏菌,保护作用,死亡率

（5）将载玻片置于 5%伊红溶液中染色 2min；（6）将载玻片置于 95%乙醇中浸润 20 次，转移至 95%乙醇中浸泡 2min，再至 100%的乙醇中，每次 2min；（7）将载玻片置于二甲苯中，2min；将盖玻片盖好，放置于光学显微镜下观片。果车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠死亡率的影响图 1 所示，实验结果表明，车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌感染的小鼠具有护作用。鼠伤寒沙门氏菌感染后，阳性疗组感染后第五天出现死亡，其死亡率，第六天，第七天，第八天分别为 20%,40%,60%,80%；inva 敲除组在第七天，其死亡率在第在第七天，第八天分别为 10%,30%；车前子组在第八天出现死亡率在第八天，第九天分别为 20%,40%。这表明，车前子提取物对鼠伤寒沙门鼠引起的死亡率具有明显的保护作用。

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图 2 车前子提取物对感染鼠伤寒沙门氏菌 SL1344 小鼠体重的保护作用2.3 车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠盲肠病理变化的保护作用如图2所示，实验表明，车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌引起的小鼠盲肠病理变化具有很好的保护作用，如图所示，在阳性对照组中，鼠伤寒沙门氏菌处理组小鼠盲肠杯状细胞减少甚至消失，结构破坏，大量中性粒细胞浸润，而药物治疗组及inva 敲除组，小鼠的盲肠仅有不明显的皮下水肿，且杯状细胞排列整齐，结构完整，这表明车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌引起的盲肠的病理变化具有明显的保护作用。空白组 SL1344 感染组

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