复元醒脑汤及部分成分对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-11-18 02:46

　　 目的:脑卒中是导致人类死亡的第二大原因,发病率高、死亡率高、致残率高且预后效果差。脑卒中的发病机制复杂,临床上尚缺少有效的治疗药物。传统的中药验方复元醒脑汤对脑缺血有良好的治疗效果。我们通过构建SD大鼠脑缺血再灌注损伤模型(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)和PC12细胞糖氧剥夺模型(oxygen and glucose deprivation,OGD),对复元醒脑汤及制天南星主要活性成分盐酸水苏碱和秋水仙碱的脑保护作用进行研究,并对盐酸水苏碱和秋水仙碱的作用机制进行了研究。方法:1.采用线栓法构建SD大鼠脑缺血2h后再灌注损伤24h模型。动物随机分为假手术组、模型组、复元醒脑汤低剂量组(5.5g/kg)、中剂量组(11g/kg)和高剂量组(22g/kg)。脑缺血15min后灌胃给药一次。盐酸水苏碱(30mg/kg)和秋水仙碱(0.5mg/kg)给药组,缺血15min后尾静脉给药一次。再灌注24h后对动物进行行为评分,取全血离心后取血清,检测血清中SOD和MDA的含量变化,ELISA检测血清中TNF-α和IL-1β的变化;取脑组织进行相关染色观察脑组织损伤情况以及病理形态的变化和神经细胞凋亡情况等。2.构建PC12细胞缺糖缺氧模型,用细胞培养箱和缺氧装置构建细胞模型。实验分为正常对照组、OGD组、盐酸水苏碱和秋水仙碱给药组,缺氧前2h给予药物治疗,给药组和OGD组放入缺氧装置中缺氧6h,正常对照组不做处理。缺氧结束之后,MTT检测实验各组细胞存活情况,利用流式细胞检测技术检测凋亡和细胞内ROS含量的变化情况,利用western blot方法分析了NF-κB、MAPK和JAK2-STAT3通路相关蛋白的表达情况。结果:1.与缺血再灌注模型组相比复元醒脑汤低、中、高(5.5、11、22g/kg)剂量给药组、盐酸水苏碱以及秋水仙碱给药组大鼠神经功能评分明显降低(P0.05);TTC染色结果显示复元醒脑汤给药组脑梗死百分比与模型组相比显著下降(P0.05);HE染色结果显示模型组大鼠脑组织细胞损伤严重,细胞间隙变大,细胞核皱缩,给药各组大鼠脑组织细胞损伤减轻;TUNEL染色结果显示假手术组大鼠脑组织细胞形态正常没有棕色的凋亡细胞,与模型组相比给药各组凋亡细胞数目减少且具有统计学意义(P0.05);NISSL染色结果显示给药各组完整神经细胞数目较模型组增多(P0.05)。比较实验各组血清中SOD和MDA的含量变化,给药各组SOD的含量较模型组上升(P0.01);MDA含量较模型组有所下降(P0.05);ELISA检测血清中TNF-α和IL-1β的变化,实验各组较模型组均下降(P0.05)。2.MTT法检测细胞生存率,与OGD组细胞相比,盐酸水苏碱和秋水仙碱给药组细胞的生存率上升(P0.05);盐酸水苏碱和秋水仙碱可以减少OGD刺激引起的细胞凋亡,并且可以降低细胞内ROS的表达(P0.05);在m RNA水平上盐酸水苏碱和秋水仙碱可以降低TNF-α和IL-1β的表达(P0.05),在相关异常蛋白表达上给药组与OGD组相比得到改善(P0.05)。结论:1.复元醒脑汤能够改善SD大鼠缺血再灌注损伤引起的行为障碍以及减少脑组织梗死面积百分比,减轻脑神经细胞的损伤情况具有脑保护作用;盐酸水苏碱和秋水仙碱对脑缺血再灌注损伤也具有保护作用。2.盐酸水苏碱和秋水仙碱能够提高OGD刺激后PC12细胞的生存率,减少细胞的凋亡,降低细胞内ROS的含量,降低炎症因子的含量,减少OGD刺激引起的细胞损伤。3.盐酸水苏碱和秋水仙碱可能通过降低OGD刺激后PC12细胞p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、p-p38、p-JNK蛋白的表达从而发挥保护作用。
【学位单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

.1.1 实验动物成年健康雄性 SD 大鼠，体重（260±20）g 购于上海斯莱克实验动物公司，实验动物在术前饲养 1 周适应环境，饲养于第二军医大学药学院温（25±2）℃，相对湿度 70%左右，8:00-20:00 自动照明。保持自由进实验动物均符合实验动物伦理学要求，实验期间均受到人性化对待。.1.2 实验药物复元醒脑汤复方的组成药材为人参10g，水蛭12g，制天南星9g，大黄(后七 15g。人参（批号：160802）购于亳州市华云中药饮片有限公司，水：160301）、制天南星（批号：160601）、大黄（批号：160501）、三：160401）等均购于上海龙威医药有限公司，福建孟氏药业有限公司生中使用的中药材、中药饮片的标准执行中国药典一部 2015 年版。盐酸水苏碱和秋水仙碱均购自于大连美仑生物技术有限公司，结构式

的说明书中的介绍提前将试剂盒恢复室温，制备标准曲线并对样本进行检测。1.3 统计学分析实验数据结果以均数±标准差（mean±SD）表示，使用 GraphPad Prism 软件数据进行统计处理，采用单因素方差分析 (One-way ANOVA）检验差异的显著性以 P<0.05 为具有统计学意义。2 实验结果2.1 复元醒脑汤对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用2.1.1 复元醒脑汤改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经行为学评分脑缺血再灌注损伤会导致大鼠运动功能失衡，行为学发生明显的变化，实采用神经功能缺损评分。假手术组大鼠行为学反应正常，模型组的行为学评分为2.70±0.13，给药组三个剂量的大鼠行为学都得到了不同程度的改善，与假手术相比（P<0.01），低剂量组为 2.25±0.14，中剂量组为 2.00±0.12，高剂量组1.71±0.14，与模型组比较有显著性差异（P<0.01），结果如下图。

图 3.复元醒脑汤对大鼠脑缺血再灌注损伤脑梗死的影响 TTC 染色典型图；B. 脑梗死百分比的影响。**P<0.01，模型组 vs.假手术组；模型组 vs.给药组（n=10）Fig3. Effect of Fu-Yuan-Xing-Nao Decoction on cerebral infarct areas in rat brai复元醒脑汤减轻脑缺血再灌注损伤大鼠的脑组织病理学改鼠脑缺血 2h 再灌注 24h 以后各实验组 HE 染色结果显示，假手术组层神经细胞无明显缺血损伤表现，神经细胞形态正常，排列整齐，细胞核清晰（图 4a）。模型组神经细胞体积变小，细胞核出现皱缩间间隙变大（图 4b）。复元醒脑汤能明显减轻和改善缺血再灌注造结构的损伤，其中高剂量组改善作用较为明显。
【参考文献】

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1 耿贇;方邦江;马智慧;陈振翼;;复元醒脑汤治疗急性缺血性中风的临床研究[J];中国中医急症;2014年11期

2 高红莉;叶文静;曲晓兰;杨明峰;刘昭纯;;血府逐瘀汤对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及其作用机制[J];中国医院药学杂志;2014年13期

3 龙建飞;张弛;张秋霞;王蕾;赵晖;边宝林;赵海誉;;黄连解毒汤有效部位对脑缺血大鼠半暗带神经元NeuN、Caspase-3、PARP表达的影响[J];北京中医药大学学报;2014年02期

4 刘瑞;高维娟;钱涛;王利;董雅洁;董贤慧;;黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马神经元形态学和Apaf-1表达的影响[J];天津医药;2013年12期

5 孙寒静;黎同明;王桂香;;血府逐瘀汤对大鼠局灶性脑缺血模型的保护作用[J];中医学报;2013年07期

6 王远;王海桃;;银杏叶总黄酮对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J];中国执业药师;2012年11期

7 王月华;贺晓丽;李晓秀;秦海林;杜冠华;;小续命汤有效成分组对慢性脑缺血大鼠脑线粒体的保护作用[J];中西医结合学报;2012年05期

8 刘莎莎;高维娟;钱涛;张霞;;黄芪注射液腹腔注射脑缺血再灌注模型大鼠海马组织神经元凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达[J];中国组织工程研究;2012年20期

9 连红琴;秦铮然;张月虹;徐叶锋;李金辉;;桃红四物汤对实验性大肠癌Bcl-2/Bax蛋白及Casepase-3mRNA表达的影响[J];中华中医药学刊;2011年10期

10 王莹;李文媛;杨春壮;;黄芪皂甙Ⅳ联合BMSCs移植对大鼠脑缺血再灌注海马神经细胞凋亡及Livin、Caspase-9蛋白的影响[J];中西医结合心脑血管病杂志;2011年08期

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1 王昀;川芎嗪抗缺血再灌注损伤作用与JNK信号通路的相关性分析[D];广州中医药大学;2012年

本文编号：2888244