目的本研究以山西道地药材远志为对象,利用现代提取分离方法、仪器分析鉴定技术对远志糖蛋白类成分的提取工艺、分离纯化、结构表征及体内外抗衰老活性进行了系统的分析研究,并进一步从血清代谢组学的角度,对其发挥抗衰老活性的代谢通路进行初步探索,以期为远志药材药效活性物质的研究开拓新的领域。方法以蛋白得率为评价指标,从p H值、温度、盐浓度、液料比、提取时间五个方面进行单因素试验,根据单因素试验结果,选取其中影响较大的三个因素,运用响应曲面方法考察远志糖蛋白的最佳提取工艺。以优选工艺得到的远志总糖蛋白(PG)为研究对象,考察不同剂量总糖蛋白对D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用,试验结束后,测定血清及脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及丙二醛(MDA)等指标的变化情况,对总糖蛋白的抗衰老活性进行初步验证。采用DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析对总糖蛋白进一步分离纯化,以多糖和蛋白含量为指标绘制洗脱曲线,收集纯化后的糖蛋白纯品,经SDS-Page电泳法验证其纯度并测定其分子量,在此基础上,采用紫外光谱、红外光谱、氨基酸自动分析等方法对其结构组成进行初步表征。对糖蛋白纯品进行体外抗氧化活性评价,包括清除DPPH自由基能力、清除羟自由基能力以及FRAP总还原能力。在前期体内抗衰老试验的基础上,通过GC-MS气质联用技术,采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)、单变量统计分析(UVA)及差异化合物筛选、代谢通路分析等分析方法,筛选血清中与抗衰老作用相关的代谢标记物,并匹配相应的抗衰老作用通路。结果采用p H=7.85的Tris-HCl(Na Cl浓度0.1 mol/L)缓冲液,以液料比8 m L/g、温度33℃水浴提取1.5h条件下,蛋白得率最高,可达(5.96±0.045)%。总糖蛋白体内抗衰老试验结果显示,与空白组比较,模型组胸腺指数和脾脏指数均显著降低(P0.05或P0.01),血清和脑组织中SOD活力、MDA含量显著降低(P0.05),血清中CAT活性极显著降低(P0.01)。与模型组比较,高剂量组血清中SOD活力显著升高(P0.05),脑组织中MDA含量极显著降低(P0.01),中、高剂量组血清中CAT活性极显著升高(P0.01)。分离纯化结果表明,以DEAE-52为交换填料,采用不同离子强度的缓冲液进行分阶段洗脱,以缓冲液Buffer D(p H=7.85 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液含0.3 mol/L Na Cl)洗脱出来的组分,其蛋白和多糖含量成峰型对称分布,经SDS-Page电泳法验证其为电泳纯纯度,分子量为36k D,经红外光谱检测,该糖蛋白(PG-D)在3230、2930、1640、1550、1458、1030、898cm-1附近均表现出明显的蛋白和多糖分子的特征吸收峰;紫外β-消除反应前后对比显示240nm处有吸收强度的变化,说明该糖蛋白中糖肽键类型为O-糖肽键;氨基酸自动分析结果显示,该糖蛋白中包含18种不同类型的氨基酸,除色氨酸在酸水解过程中被破坏掉以外,其余7种人体必需的氨基酸均被检测出来。对纯品进行体外抗氧化活性结果综合表明,在一定的浓度范围内,远志总糖蛋白(PG)和纯品(PG-D)均具有一定的抗氧化活性,糖蛋白纯品的抗氧化表现力介于Vc和总糖蛋白之间,VcPG-DPG。血清代谢组学结果显示,经OPLS-DA分析后,综合VIP值(变量重要性投影值)1及P0.1,空白组与模型组之间、模型组与中量组之间共筛选得到6个共有差异代谢物,包括尿嘧啶核苷、塔格糖、环己基甲酰氨、糖酸、尿嘧啶、天冬酰胺,并且与空白组相比,这6种差异物均有升高的趋势,但在远志糖蛋白干预后又均下降,其变化趋势反映了衰老模型的建立以及在糖蛋白干预后的代谢调节作用。远志糖蛋白干预衰老小鼠后,将主要从嘧啶代谢、抗坏血酸代谢、泛酸盐和辅酶A生物合成、β-丙氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、半乳糖代谢等代谢通路上发挥抗衰老作用,其中嘧啶代谢、抗坏血酸代谢、半乳糖代谢分别涉及核苷酸代谢、碳水化合物合成代谢及糖代谢,初步说明远志糖蛋白将主要从这些代谢途径上干预机体的衰老活动。结论采用响应曲面方法建立的模型预测准确,可较好地优选出远志糖蛋白的最佳提取工艺,利用该工艺提取得到的总糖蛋白对D-半乳糖致衰老小鼠有一定的抗衰老活性,并经血清代谢组学方法分析得到其抗衰老通路与核苷酸代谢、碳水化合物合成代谢及糖代谢等途径相关,后期对纯品的初步结构表征及抗氧化活性评价结果显示,纯品的抗氧化能力要强于总糖蛋白部位,上述研究结果可为远志药材的药效活性物质研究及其进一步产品开发提供基础依据。
【学位单位】：山西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：
图 1-1 蛋白质的标准曲线线的回归方程为：y=5.785x+0.0272 （r=0.9991），其中浓度（单位为 mg/mL，线性范围：0.04~0.12 mg/mL）具有良好的线性关系。
图 1-2 缓冲液 pH 值对蛋白得率的影响H 从 7 到 8 蛋白得率呈上升趋势，大于 8 之后开始下降接影响蛋白质的带电情况，进而影响到蛋白质在提取液蛋白质的等电点偏低，故一般比较适宜采用偏碱性的条
图 1-3 温度对蛋白得率的影响0-40 ℃范围内，随着温度的升高，糖蛋白得率不断增加却反而开始下降，最佳提取温度为 40 ℃。这是因为在的升高，可加速溶剂对药物主要成分的解吸和溶解，但[12]
【参考文献】
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本文编号：
2890142
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