积雪草酸对人肝癌SMMC-7721细胞体内外增殖和凋亡的影响

发布时间：2020-11-20 05:08

　　 目的:研究积雪草酸(AA)对人肝癌SMMC-7721细胞体外增殖及凋亡的影响;利用小动物活体成像技术观察AA对人肝癌裸鼠移植肿瘤生长的影响,从而研究AA体内抗肝癌效应及其凋亡的机制方法:不同浓度的AA作用于人肝癌SMMC-7721细胞24 h后显微镜观察其细胞形态变化,CCK-8法检测各组细胞活力值,AnnexinV-APC/7-AAD双染色法流式细胞术检测肝癌细胞凋亡率变化,JC-1试剂盒检测肝癌细胞线粒体膜电位改变,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3和Cleaved Caspase-3在肝癌细胞中的表达。荧光素酶逆转录病毒转染人肝癌SMMC-7721细胞,嘌呤霉素梯度筛选得到稳定感染的克隆肝癌细胞(简称SMMC-7721-Luc)。选用4~5周龄雄性BALB/c裸鼠15只,建立人肝癌SMMC-7721-Luc细胞裸鼠皮下移植瘤模型后,随机分为模型组、AA 50mg/Kg组和AA 100mg/Kg组,每组5只。各组裸鼠连续灌胃给药21 d,分别于给药第7 d,14 d,21 d进行活体成像观察,并在末次活体成像观察后处死裸鼠后取瘤块称重并测量其体积大小,HE病理染色观察瘤块内细胞形态以及数量的变化;TUNEL染色法检测瘤块细胞凋亡情况;免疫组织化学法测定瘤块P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3的阳性表达的平均积分光密度值(IOD);Western Blot法测定凋亡相关蛋白P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3和Cleaved Caspase-3在肿瘤组织中的表达。结果:CCK-8结果显示:与溶剂对照组相比,随着AA浓度的增加,抑制率增大,细胞数量变少,形态变圆,呈浓度依赖性(P0.01),IC_(50)=38.31μM;AnnexinV-APC/7-AAD双染色法流式结果显示:与溶剂对照组相比,随着浓度的增加,AA显著提高对人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡率(P0.01);此外,JC-1结果显示:与溶剂对照组比较,AA浓度依赖性降低线粒体膜电位(P0.01),在荧光显微镜下可以看到红色/绿色荧光的比值随浓度的增大而明显降低;Western blot结果显示:40μM AA明显上调Bax,Cyt-C和Cleaved Caspase-3蛋白的表达(P0.05或P0.01),下调Bcl-2,Caspase-3的表达(P0.01),但不影响P53的表达(P0.05)。在体内实验中,成功构建了人肝癌SMMC-7721-Luc裸鼠皮下移植瘤模型。活体成像动态观察显示,与模型组相比较,50mg/Kg组和100mg/Kg组的AA能明显抑制肿瘤的增长(P0.01);瘤块称重和体积测量结果显示:与模型组比较,100mg/Kg的AA能明显减少瘤块的质量和体积(P0.01)。HE病理染色结果显示,与模型组相比,AA 50mg/Kg和AA 100mg/Kg剂量组均能不同程度地促进肝肿瘤组织细胞凋亡:细胞呈现凋亡形态,细胞数减少;TUNEL染色结果显示:与模型组比较,50mg/Kg AA组和100mg/Kg AA组均能使肝肿瘤细胞凋亡率逐渐增高(P0.01);免疫组织化学方法结果显示:与模型组比较,Bax,Cyt-C,Caspase-3在AA 50mg/Kg剂量组和AA 100mg/Kg剂量组中平均积分光密度值阳性表达区域均明显升高,Bcl-2阳性表达区域降低,差异均有统计学意义(P0.01),P53表达无明显变化,无差异统计学意义(P0.05);Western Blot结果显示,与模型组相比,Bax,Cyt-C,Cleaved Caspase-3蛋白表达在50mg/Kg和100mg/Kg AA组中均明显升高,Bcl-2和Caspase-3蛋白表达降低(P0.05或P0.01),P53蛋白表达无明显变化,统计学无差异(P0.05)。结论:AA可抑制人肝癌SMMC-7721细胞体外增殖及裸鼠移植瘤体内生长,其机制可能与AA诱导非P53依赖的线粒体途径的凋亡有关。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285
【部分图文】：

图 1：积雪草酸化学结构式Figure 1 The chemical structure ofAsiaticAcid现，AA 在癌症肿瘤的防治领域具有良联合使用能保护肝脏，降低毒副作用[11]素瘤[12]；通过激活人乳腺癌细胞外信号激酶的通路，诱导细胞凋亡和细胞周期[13]；AA 还通过抑制肿瘤细胞增殖的作与人肝癌细胞凋亡的调控过程[14]。用于在对抗癌症方面和开发各种肿瘤的得了一定的初步进展，但是 AA 用于国人口基数大，是世界上肝癌的患病大 据研究报道可以用于保护肝脏，保护脑

1 不同浓度 AA 作用 24 h 对人肝癌 SMMC-7721 细胞形态的影响（orphological changes of human hepatoma SMMC-7721 cells affected24 h (×200)图 1-1-2 AA 对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖的影响（n=3） Effect ofAAon the proliferation of human hepatoma SMMC-7721 ceV-APC/7-AAD 双染色法流式细胞术检测 A细胞的凋亡影响

19图 1-1-2 AA 对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖的影响（n=3）ect ofAAon the proliferation of human hepatoma SMMC-77APC/7-AAD 双染色法流式细胞术检测胞的凋亡影响APC/7-AAD 双染色法流式细胞术凋亡检测（3.06±0.08）%，与溶剂对照组比较，随着 A癌 SMMC-7721 细胞产生明显的凋亡，并且
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