脂肪组织通过前脂肪细胞的增殖,分化和凋亡的组合形成。肥胖及其相关疾病就是由于脂肪组织过度增长而引发,因此对脂肪细胞的分化调控和成熟脂肪细胞的降解调控则是研究肥胖及其相关疾病的关键点。脂滴(LD)在细胞中充当亚细胞结构并存在于所有生物的体细胞中。长期以来,在脂肪细胞中,脂肪滴仅被认为是脂质的储存结构,并且是为身体提供能量的储存池。并为生物大分子的合成提供脂质原料,如新生细胞膜和脂蛋白等,但是近十年来的研究表明,脂肪滴作用的多样化远超乎了人们的想象。在脂肪代谢的调节中,脂肪滴不是被动的储存场所,而是高度活跃且重要的细胞器。科学家通过研究脂肪滴相关疾病揭示了脂肪滴的多样性。脂肪滴异常会导致的相关疾病有:肥胖、衣原体感染、糖尿病、动脉粥样硬化症及肝脏疾病等多种疾病,而这些疾病的始动环节就是脂代谢的紊乱。虫草素(3'-脱氧腺苷)最初从蛹虫草中分离,作为减肥和降脂的天然化合物。具有良好的发展前景,其优点是多目标,多渠道,无毒副作用。它具有多种生物和药理活性,包括降血糖,抗糖尿病,抗癌,免疫刺激,抗病毒和抗感染。由于其药理学和治疗意义广泛,受到越来越多的关注。本课题组前期研究发现,虫草素在减肥的同时也显著地降低了脂肪细胞里面的脂肪滴含量,故虫草素能否通过抑制脂肪细胞脂肪滴形成、生长和诱导脂肪滴的降解来调节脂肪细胞脂类代谢是一个值得探究的科学问题。本研究首先通过构建大鼠肥胖模型评价虫草素的减肥效果和对不同脂肪组织(白色脂肪、黄色脂肪和褐色脂肪)及血脂、脂肪细胞内脂肪滴的影响;然后以3T3-L1脂肪前体细胞作为脂肪代谢的模型细胞,考察虫草素是否能够抑制脂肪细胞脂肪滴形成、生长和诱导脂肪滴的降解;最后针对体外3T3-L1细胞,利用分子生物学手段对虫草素影响脂肪滴的含量调节脂肪细胞脂类代谢的可能机制进行初步研究。首先,我们通过给予SD大鼠高脂饲料,构建了脂肪细胞脂类代谢紊乱的代表性疾病肥胖的动物模型。给SD大鼠低,中,高剂量(12.5,25,50 mg/kg)的虫草素,连续灌胃8周后,测定体重,脂肪系数和相关的生化指标。并观察肝组织和脂肪组织的病理变化。提取大鼠脂肪细胞,用ASC-1、PAT2和P2RX5分别标记白色脂肪、黄色脂肪和褐色脂肪,并用BODIPY染色检测脂肪滴含量的变化。实验结果表明,给予高剂量(50 mg/kg)虫草素的大鼠可以显著降低体重和脂肪系数(P0.01),中剂量(25 mg/kg)虫草素大鼠体重和脂肪系数显著降低(P0.05),低剂量的虫草素组(12.5 mg/kg)不会降低大鼠的体重和脂肪系数;虫草素显著降低血清甘油三酯(TG),胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL),天冬氨酸氨基转移酶(AST),丙氨酸氨基转移酶(ALT),丙二醛(MDA)和外周蛋白(Perilipin1、Perilipin2、Perilipin3)含量(P0.01),并显著提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P0.01);高剂量的虫草素(50 mg/kg)极显著增加高密度脂蛋白(HDL)(P0.01),中剂量组(25 mg/kg)显著增加HDL(P0.05)。肝脏病理切片显示低,中,高剂量(12.5,25,50 mg/kg)虫草素均能对高脂饮食诱导造成的肝脏损伤起到一定的保护作用;脂肪病理切片的HE染色结果显示,低,中,高剂量(12.5,25,50 mg/kg)的虫草素可显著抑制脂肪细胞的增加;虫草素还能以剂量依赖性方式显著降低白色脂肪细胞的含量(P0.05),它显著促进了黄色脂肪细胞的燃烧(P0.01),显著增加了棕色脂肪细胞的含量(P0.01),这表明虫草素可以加速脂肪细胞的转化,从而促进脂肪的消耗;另外,对来自体内脂肪细胞内的脂肪滴检测结果显示,低、中、高剂量(12.5,25,50 mg/kg)虫草素以剂量依赖性方式减少脂肪细胞中的脂肪滴。其次,我们在体外培养3T3-L1细胞,诱导剂1(含有IBMX,胰岛素,地塞米松,青链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基)和诱导剂2(含有胰岛素,青链霉素和10%胎牛血清DMEM培养基)诱导3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞,分别在加诱导剂的不同时间段加虫草素以检测虫草素对脂肪滴形成、生长和降解三个不同阶段的影响,虫草素均给予不同浓度(1.563、3.125、6.25、12.5、25μg/mL),作用时长为168小时,用BODIPY染色,通过荧光显微镜检测,并且通过Image J软件定量脂肪滴的含量。实验结果显示,虫草素以浓度依赖的方式显著抑制脂滴的形成和生长,并且诱导成熟脂肪细胞中的脂滴降解,促进脂肪细胞的去分化。最后,针对诱导剂1(含IBMX、胰岛素、地塞米松、青链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基)和诱导剂2(含有胰岛素,青霉素和10%胎牛血清DMEM培养基)诱导3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞,利用western blot技术检测与脂肪滴形成相关基因Perilipin2、Perilipin3、Fsp27和PPAR-γ的表达情况;通过蛋白质印迹检测与脂肪滴生长相关的Rab5,Rab11和Fsp27的表达。通过蛋白质印迹检测与脂肪滴降解相关的ATGL,CGI-58和Perilipin1的表达。结果显示:虫草素通过下调Fsp27、Perilipin2和Perilipin3的表达来显著抑制脂滴的形成,而PPAR-γ没有参与这一过程。经6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL虫草素处理,Rab5的蛋白质表达略微降低;经6.25μg/mL和25μg/mL虫草素处理,Rab11表达水平显著降低;经25μg/mL虫草素处理,Fsp27的蛋白质表达显著降低;这表明虫草素通过调节Rab5,Rab11和Fsp27抑制分化的3T3-L1细胞中脂肪滴的生长。虫草素处理导致Perilipin1和CGI-58表达水平显著降低,相反,ATGL表达显著增加,这表明虫草素可通过增加ATGL表达和减少Perilipin1表达而不是通过影响CGI-58表达来发挥降解脂肪作用。这些结果表明,虫草素抑制脂肪滴的形成、生长相关基因的表达,并抑制和诱导与脂肪滴降解相关的基因的表达。从而影响脂肪滴的含量,实现脂肪细胞脂质代谢的调节。总之,本研究结果表明,虫草素对肥胖模型大鼠具有减肥的作用;虫草素体外调节脂肪细胞脂类代谢的机制是通过影响脂肪滴的含量实现的,包括下调Fsp27、Perilipin2和Perilipin3的表达来较少脂滴的形成;下调Rab5、Rab11和Fsp27的表达抑制的脂肪滴分化;增加ATGL表达和降低Perilipin1表达来降解脂肪滴。这些结果为虫草素作为新型减肥药物进一步开发提供了实验基础和理论基础。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
脂肪滴的基本形态
图 3.2 通过内质网内的应力形成 LD 的模型2 Models of LD formation through stress within the endoplasmic re肪滴的生长过程
脂肪滴生长机制Fig3.3MechanismsofLDgrowthinclude
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本文编号：
2893781
