蜚蠊肠道内生粘质沙雷氏菌次生代谢产物灵菌红素的抗肿瘤活性初步研究

发布时间：2020-11-22 00:06

　　 灵菌红素(Prodigiosin)是一类天然红色色素的总称,具有抗菌、抗疟原虫、免疫抑制和抗肿瘤等生物活性。美国国立癌症研究所(NSI)报道,灵菌红素对57种人源性肿瘤细胞具有抗性,但对正常细胞不具明显的毒性,说明灵菌红素具有成为抗肿瘤药物的潜力。粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是灵菌红素主要产生菌,假单胞菌和放线菌等微生物也具有产生灵菌红素能力。我们课题组从中药蜚蠊肠道中分离得到4株粘质沙雷氏菌,其中菌株WA12-1-18具有稳定产生红色色素的能力,经鉴定该红色色素为灵菌红素。在此基础上,采用体外细胞实验和体内荷瘤裸鼠动物实验初步研究灵菌红素的抗肿瘤活性。1、研究目的评价蜚蠊肠道粘质沙雷氏菌次生代谢物灵菌红素的抗肿瘤活性,并初步探讨其抗肿瘤作用机制,为灵菌红素开发成新一代抗肿瘤药物奠定理论条件。2、研究方法(1)蜚蠊肠道内生粘质沙雷氏菌WA12-1-18的形态和分子鉴定光学显微镜和扫描电子显微镜观察菌株WA12-1-18的形态特征,16S rDNA、BLAST同源性比对、MEGA软件构建N-J系统发育树等方法对菌株进行分子生物学分类与鉴定。(2)灵菌红素制备与鉴定采用固体发酵法对粘质沙雷氏菌WA12-1-18进行发酵,经硅胶柱层析等技术分离纯化得到红色色素单体后,采用高效液相(HPLC)、紫外(UV)、红外(IR)、液质联用(LC-MS)和核磁共振(NMR)等技术鉴定该化合物结构。(3)灵菌红素体外抗肿瘤作用以宫颈癌细胞Hela、鼻咽癌细胞CNE-2、耐紫杉醇肺癌细胞A549T、耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR为实验对象,通过MTT法、流式细胞术、荧光染色、电子显微镜、Westernblot和qRT-PCR法等技术检测灵菌红素的体外抗肿瘤活性。(4)灵菌红素体内抗肿瘤作用通过体内Hela荷瘤裸鼠实验,初步评价灵菌红素体内抗肿瘤作用及其对心、肝、脾、肾等主要生命脏器的影响。3、研究结果(1)蜚蠊肠道内生粘质沙雷氏菌WA12-1-18的分离与鉴定从蜚蠊肠道分离得到的红色菌株WA12-1-18经形态学鉴定为革兰氏阴性红色短杆菌,经分子生物学鉴定,与来源于土壤的粘质沙雷氏菌相似度为99.58%,初步鉴定WA12-1-18是粘质沙雷氏菌。(2)灵菌红素制备与鉴定分离纯化后得到红色粉末,产量达到2.77 g/L。经高效液相、紫外、红外、液质联用以及核磁共振鉴定该产物为灵菌红素。稳定性实验结果表明:灵菌红素宜在酸性、暗处、温度不超过60℃的条件下储存,另外灵菌红素对个别金属离子容易发生螯合作用。(3)灵菌红素体外抗肿瘤作用灵菌红素对宫颈癌Hela、鼻咽癌CNE-2、耐紫杉醇肺癌A549T、耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR的生长具有抑制作用,并可改变各肿瘤细胞生长周期的分布和诱导肿瘤细胞发生凋亡,作用效果与作用时间和药物浓度呈依赖关系。扫描电镜和透射电镜结果表明,灵菌红素能使Hela、CNE-2细胞膜表面坍塌皱缩以及尾足消失,细胞内部产生空泡结构,核边集化,并产生部分凋亡小体。Westernblot以及qRT-PCR结果表明,灵菌红素可以抑制Hela细胞抑凋亡基因Bcl-2以及促进促凋亡基因Bax的活化,引起caspase-3的活化,最终导致肿瘤凋亡。(4)灵菌红素体内抗肿瘤作用灵菌红素可以有效地抑制宫颈癌荷瘤裸鼠的瘤体生长,抑制率达到20.6%。瘤体病理组织HE结果显示,灵菌红素治疗组肿瘤细胞稀疏,核小且染色浅,部分核固缩。免疫组化结果表明,灵菌红素可抑制抑凋亡基因Bcl-2和促进促凋亡基因Bax的表达。另外,灵菌红素对裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃等主要生命脏器均无不良影响。4、研究结论蜚蠊肠道内生粘质沙雷氏菌WA12-1-18具有稳定产生灵菌红素的生物特性,体外细胞和荷瘤裸鼠动物实验均发现灵菌红素具有抗肿瘤活性。为灵菌红素的临床应用奠定了理论基础。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：

广东药科大学硕士研究生毕业论文 粘质沙雷氏菌 WA12-1-18 形态学鉴定菌株 WA12-1-18 在 LB 固体培养基上 28 ℃培养 3 天后，光学显微镜表面光滑，呈球状凸起，具粘稠，颜色为鲜红色（图 2-1A）；经革发现菌体被染成红色（图 2-1B），提示菌株 WA12-1-18 为革兰氏阴电镜结果显示，菌株 WA12-1-18 菌体呈短杆状，两端稍圆，无芽孢（图

图 2-2 菌株 WA12-1-18 的 PCR 扩增产物凝胶电泳检测以及 16S rDNA 序列②菌株 WA12-1-18 系统发育树分析将菌株 WA12-1-18 的测序结果同 GenBan 数据库中的相似菌株进行 16rDNA 比对，结果见图 2-3，采用 DNAman6.0 进一步分析发现，菌株 WA12-1-与粘质沙雷氏菌相识度高达 99.58%。通过 Mega5.1 软件，采用最大似值法构建菌株 WA12-1-18 系统发育树（图 2-4），结果表明菌株 WA12-1-18 为粘质沙雷菌属。

图 2-2 菌株 WA12-1-18 的 PCR 扩增产物凝胶电泳检测以及 16S rDNA 序列②菌株 WA12-1-18 系统发育树分析将菌株 WA12-1-18 的测序结果同 GenBan 数据库中的相似菌株进行 16SrDNA 比对，结果见图 2-3，采用 DNAman6.0 进一步分析发现，菌株 WA12-1-18与粘质沙雷氏菌相识度高达 99.58%。通过 Mega5.1 软件，采用最大似值法构建菌株 WA12-1-18 系统发育树（图 2-4），结果表明菌株 WA12-1-18 为粘质沙雷氏菌属。
【参考文献】

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本文编号：2893806