九香虫HPLC指纹特征鉴别与抗凝血活性研究

发布时间：2020-11-22 04:00

　　 九香虫为蝽科动物九香虫Aspongopus chinensis Dallas的干燥全虫,主产于贵州、四川、云南等地,江苏、安徽、浙江、湖南、湖北、广东、广西等地亦产。九香虫为我国特有种,其药材价格昂贵,市场上存在着多种混伪品,药材质量差别较大,形态鉴定是九香虫常用的鉴定方法,但九香虫与其混伪品的形态特征相似,需要具备较强的分类学专业知识,且主观性较强。HPLC法可以反映中药中化学成分的种类和含量高低等,是中药真伪鉴定和质量控制的有效方法。本研究拟通过其所含的化学成分来探讨鉴别九香虫药材真伪的可行性,为九香虫药材的真伪鉴定提供较为客观的化学鉴定方法。中医认为九香虫具有理气止痛、温中助阳功效,现代医学临床研究表明,九香虫具有较好的抗凝血作用,但其相关的药理研究较少,有效活性部位以及药理作用机制尚不明确,活性成分未见报道。本研究期望通过动物体内实验来探究九香虫抗凝血活性机制,并筛选出有效活性部位,以期为九香虫的临床应用和研究提供依据。目的:鉴别九香虫真伪,筛选九香虫提取物抗凝血活性,探究其抗凝血活性作用机制及有效活性部位。方法:1.收集云南、贵州、四川和广西等地的25批九香虫药材,建立HPLC指纹图谱,利用化学计量法中的主成分分析和聚类分析方法鉴别九香虫正品与伪品。2.通过测定部分凝血活酶时间(Activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)研究九香虫水煎提取物、水提醇沉上层溶液、水提醇沉沉淀物和乙醇提取物的抗凝血活性。采用毛细管法测定小鼠的凝血时间(Coagulation time,CT)值,断尾法测定小鼠尾尖出血时间(Bleeding time,BT)值,来验证九香虫在动物体内的抗凝血药效。并通过大鼠体内凝血功能实验,家兔体外血小板聚集实验,初步探究九香虫抗凝血作用机制。3.对九香虫提取物进行分离纯化,经D101大孔吸附树脂柱色谱分离,得到不同乙醇浓度的洗脱部位,并分别测定其抗凝血活性,找出有效活性部位。纯化活性部位,筛选出抗凝血活性单体。结果:1.九香虫药材鉴别:25批九香虫药材商品,性状鉴定为正品8批,伪品14批(包括小皱蝽、麻皮蝽、无刺蝽、黑兜虫、荔蝽等品种),掺伪品3批。通过HPLC法对25批药材商品进行分析,其中麻皮蝽与九香虫正品无共有峰,九香虫若虫与九香虫正品只有3、4号峰为共有峰,但含量差别较大,图谱形状不一,HPLC法可以直接将麻皮蝽和若虫鉴定出来。其余22批药材建立HPLC指纹图谱,生成对照图谱R,含有6个共有峰。不同批次之间HPLC图谱与对照图谱R的相似度在0.643-0.964之间,正品和混伪品之间化学成分含量差异较大。运用主成分分析法对22批样品共有峰的峰面积进行统计分析,其中第1、第2和第3主成分的累积贡献率达到91.55%,具有较高的代表性,其结果显示小皱蝽与九香虫正品区别较大。在主成分分析的基础上,以降维后的三个主成分为变量,系统聚类方法采用组之间的链接法与平方欧式距离法,结果显示九香虫正品聚为一类、小皱蝽聚为一类、其余样品分为两类,只有一批掺伪品归为九香虫正品中,可能原因是掺伪品中九香虫占比较多,化学成分主要以正品体现居多。聚类分析方法与主成分分析方法结果基本一致。2.九香虫抗凝血活性药效研究:水煎液提取物和水提醇沉上层溶液具有明显的抗凝血作用,抗凝血有效物质应集中在水提醇沉上层溶液中。九香虫水提醇沉上层溶液能够明显延长小鼠的凝血时间CT值及尾尖出血时间BT值,说明九香虫水提醇沉提取物在动物体内具有明显的抗凝血活性。通过大鼠凝血功能试验,证明九香虫体内抗凝血过程是通过APTT途径,针对内源性凝血途径中存在的凝血因子发挥作用的;通过家兔体外血小板聚集实验说明,九香虫水提醇沉提取物能够影响血小板的正常生理功能,对于血小板的聚集有着显著的抑制效果。3.九香虫抗凝血活性部位以及活性成分的筛选:九香虫水提醇沉物经D101大孔吸附树脂分离后,50%、70%和90%乙醇洗脱部位活性最强,为抗凝血活性部位。以上活性部位经分离纯化,得到四个单体化合物,结构鉴定出一个化合物为aspongester A。结论:HPLC指纹图谱结合化学计量学方法,能够较为客观准确鉴别九香虫真伪。水提醇沉法为抗凝血活性部位最佳提取方法。其水提醇沉提取物在大鼠体内通过内源性凝血途径发挥抗凝血功效,并且能够抑制血小板聚集。另外,九香虫水提醇沉提取物有效活性部位集中在高浓度乙醇洗脱部位,并且从中分离纯化得到一个酯类化合物aspongester A。综合以上实验结果可知,九香虫抗凝血活性成分是可以用水煎提取的多种成分,沸水煎煮提取可以去除脂肪酸等大量杂质,但能同时保留醇溶性的活性成分,继而可通过水提醇沉法进一步精制;同时说明抗凝血活性可能是多种成分共同作用的结果,不是单一化学成分发挥药效的。本研究为九香虫药材的真伪鉴定提供了较为客观的化学鉴定方法,动物体内实验验证了九香虫提取物抗凝血活性,并探究了其抗凝血活性作用机制及有效活性部位,为九香虫的进一步开发利用研究提供了一定的依据。
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284.1;R285
【部分图文】：

湖北中医药大学 2019 届硕士学位论文剩余 22 批药材商品建立九香虫药材指纹图谱见图 1-1，以 S1 作为参比图谱，采用中位数法，在时间窗宽度为 10 时，标记共有峰 6 个，生成对照图谱 R 见图 1-2。不同品种的九香虫商品 6 个共有峰的相对峰面积数据见表 1-8，共有峰的相对保留时间见表 1-9 。S23、S24 号麻皮蝽与对照图谱 R 的对比图见图 1-3，S25 九香虫若虫与对照图谱 R 的对比图见图1-4。

麻皮蝽(S24、S23)与对照图谱R对比图

图 1-5 22 批样品主成分得分图由表 1-12 可知，6 个共有峰中，5 号峰和 6 号峰对主成分因子 1 的贡献较大，2 号峰、3 号和 4 号峰对主成分 2 贡献最大，1 号峰和 2 号峰对主成分 3 贡献大。22 批九香虫药材商品中，把外观鉴别为相同种的药材商品备注为一个编号：S1、S2、S3、S4、S9、S16、S18 和 S21 鉴定为九香虫正品标记为1，S5、S6、S7、S11、S13、S15、S17 和 S20 鉴定为小皱蝽标记为 2，S8 鉴定为荔蝽标记为 3，S12 鉴定为黑兜虫和无刺蝽的混杂品标记为 4，S22 鉴定为无刺蝽标记为 5，几个正品与伪品的混杂品分别标记为 6 和 7，具体信息见表 1-1。由主成分得分图 1-5 可知：标记为 1 的样品和 2 的样品分别较为集中，
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本文编号：2894084