目的:三黄泻心汤作为经典方剂临床上常用于动脉粥样硬化,上呼吸道感染,糖尿病肾病,胃炎胃溃疡等疾病的治疗,化学成分研究显示其主要含有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等成分。课题组前期研究炎症通路级联放大效应探索了大黄-黄芩“相使为用”增效的分子机制,建立了LPS诱导小鼠腹膜巨噬细胞Raw264.7炎症模型,以对LPS介导产生NO的抑制作用为评价指标,对黄连5个主要单体成分进行了活性筛选,针对抑制活性最佳的黄连碱对该模型中NF-κB、MAPK以及JAK/STAT炎症信号通路的激活进行了深入研究。然而,研究未涉及三黄泻心汤成分对NLRP3炎症小体通路的影响。Caspase-1作为NLRP3炎症小体的重要组成部分之一,通过体外构建caspase-1抑制剂筛选体系,再对三黄泻心汤主要单体成分进行目的性筛选,可为三黄泻心汤以及单体成分的临床使用提供理论依据。方法:(1)以caspase-1 c DNA为模板,分别以(BamH I-p20,p20-Sal I)、(BamH I-p10,p10-Sal I)以及(BamH I-p20,p10-Sal I)为上下游引物,进行PCR扩增后,使用限制性内切酶Sal I、BamHI分别消化扩增后的产物以及原核表达载体pColdI,采用T4连接酶将目的片段与原核载体连接成重组质粒,转化如宿主细胞并进行复制,利用载体自身具备的抗Amp抗生素基因,筛出重组质粒;(2)将构建好的重组质粒转入表达感受态细胞Trans BL21(DE3),利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在原核表达系统中诱导外源基因的表达。pCold I载体携带冷应激基因cspA启动子,能够在低温条件下表达,通过抑制其他蛋白质的表达来提高目的蛋白的产量。(3)亲和层析法纯化蛋白:pCold I载体携带6×His标签(His-tag),该标签能够与二价金属离子,如Ni~(2+)、Co~(2+)等螯合,通过亲和层析的方法对目标蛋白进行纯化。(4)构建caspase-1体外活性筛选体系,对三黄泻心汤主要单体成分小檗碱(Ber)、黄连碱(Cop)、表小檗碱(Epi)、巴马汀(Pal)、药根碱(Jatr)、大黄酸(Rhe)、大黄素(Emo)、芦荟大黄素(Alo)、大黄酚(Chry)、大黄素甲醚(Phy)、黄芩苷(Bae)、黄芩素(Bai)、汉黄芩素(Wogi)以及汉黄芩苷(Woga)进行抑制活性筛选,终浓度50μM;以VX-765(100nM)为阳性对照;(5)Raw264.7细胞接种于6孔板,密度达到80%换无血清培养基,黄连碱(1-30μM)作用2h后,LPS(1μg/mL)继续刺激24h,裂解细胞;SDS-PAGE上样检测,分别使用anti-TLR-4和anti-MyD88一抗检测各组蛋白表达;(6)Raw264.7细胞接种于6孔板中过夜培养,以Cop(1-30μM)、Ber 30μM预处理1h后加入Alexa Fluor 488 conjugated LPS孵育20min。使用4%多聚甲醛固定20min,TLR-4一抗于4℃条件下孵育2h,Alexa Fluor 545 conjugate二抗孵育1h,于激光共聚焦显微镜下观察。(7)THP-1细胞接种于24孔板中,100nM PMA诱导24h贴壁。用不含血清培养基换液,(1-30μM)Cop预处理1h后,分别采用IFN-γ(1000U)以及IFN-γ(1000U)+LPS(1μg/ml)继续刺激24h后,收集培养基上清,用于NO水平的检测。(8)SD大鼠脚底皮下注射角叉菜胶(carrageenan)建立足肿胀模型,使用足趾容积检测仪0-4h内检测黄连碱对carrageenan诱导的大鼠足肿胀以及体表温度升高的影响;收集大鼠肿胀部位皮下组织,冰面上匀浆,离心后得到匀浆液上清,采用Elisa法检测各组大鼠肿胀部位组织中细胞因子NO以及TNF-α的水平。结果:(1)PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,在1000bp左右能看见明显的特异性条带;p20、p10、p10(D381E)、p20p10以及p20p10(D381E)与pCold I双酶切后,连接酶分别连接过夜并转化进DH5α感受态细胞,挑取5个单克隆进行酶切鉴定以及菌落的PCR鉴定,结合测序结果表明所筛选的菌落为阳性克隆;(2)考马斯亮蓝染色,结果表明IPTG诱导后,p20、p10以及p20p10蛋白大量表达,在25kDa、14.4kDa以及45kD左右有明显条带;(3)亲和层析法纯化以上蛋白后,在包含Ac-WEHD-AMC的体系中不具有剪切活性;将上述蛋白纯化前的裂解液上清加入体系中,结果显示p20p10与p20p10(D381E)裂解液上清具备剪切活性;(4)以上泻心汤单体成分中,Cop、Jatr以及Emodin对caspase-1的活性抑制率大于60%。Cop抑制效果最佳,IC_(50)=31.66±0.22μM;(5)LPS诱导RAW264.7细胞TLR-4以及MyD88蛋白表达升高,(1-30μM)黄连碱对其无明显抑制作用;(6)黄连碱1-30μM对LPS和TLR-4的绑定无明显作用,而小檗碱30μM,与报道相符,可显著抑制该绑定;(7)IFN-γ(1000U)以及IFN-γ(1000U)+LPS(1μg/ml)均可刺激THP-1细胞释放NO,高剂量Cop对其有一定的抑制作用。(8)皮下注射角叉菜胶引起大鼠足肿胀以及肿胀部位体表温度升高,黄连碱3.87mg/kg显著抑制大鼠足肿胀程度,同时显著减少肿胀部位组织匀浆中NO和TNF-α的产量。结论:(1)三黄泻心汤主要单体成分均对caspase-1剪切活性有不同程度的抑制作用,其中黄连碱的抑制作用最强;(2)黄连碱对LPS诱导的Raw264.7细胞TLR-4和MyD88蛋白高表达无明显抑制作用,对TLR-4与LPS绑定无影响;(3)黄连碱抑制IFN-γ以及IFN-γ+LPS诱导的THP-1细胞NO释放;(4)黄连碱对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀有明显改善作用。
【学位单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
成都中医药大学硕士学位论文作为不溶蛋白分别构建、表达、纯化caspase大小亚基单一可溶性蛋白构建、表达并纯化全长的caspase-1[40,4别在包涵体中表达时，需要再折叠后纯化才能得到有剪样的，表达全长的caspase-1后也需要复性、纯化从而在]。相反的，亦有文献证实在纯化caspase过程中可不用序[43]。由于caspase-1 p10亚基不稳定，能自噬为p7，性失活，目前主要采用两种方法抑制p10自噬，分别为酸钠[44]以及对p10进行点突变处理（D381E）[43]。通过，利用带荧光标签的底物（如Ac-WEHD-AMC）可用于筛]。
成都中医药大学硕士学位论文4见以下图2、图3：图2：体外表达纯化caspase-1蛋白技术路线图，五角星代表关键步骤图3：红色五角星表示课题组前期实验已完成内容，问号表示本论文待解决问题
成都中医药大学硕士学位论文4见以下图2、图3：图2：体外表达纯化caspase-1蛋白技术路线图，五角星代表关键步骤图3：红色五角星表示课题组前期实验已完成内容，问号表示本论文待解决问题
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 SUN Yu-He;HE Xin;YANG Xiao-Lin;DONG Cui-Lan;ZHANG Chun-Feng;SONG Zi-Jing;LU Ming-Xing;YANG Zhong-Lin;LI Ping;;Absorption characteristics of the total alkaloids from Mahonia bealei in an in situ single-pass intestinal perfusion assay[J];Chinese Journal of Natural Medicines;2014年07期
2 张前;王长虹;马越鸣;王峥涛;;三黄泻心汤及附子泻心汤制备方法研究进展[J];国际药学研究杂志;2013年03期
3 张燕;朱华旭;郭立玮;;在体单向肠灌流模型研究小檗碱及其在复方配伍环境中的大鼠肠吸收特性[J];药学学报;2012年02期
4 王进荣;王平;杨永茂;孟宪丽;张艳;;单向灌流法评价芦荟大黄素大鼠体内肠吸收的研究[J];中国中药杂志;2011年17期
5 呼海娟;韩梅;孙荣华;刘彬;温进坤;;黄芩苷抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖和新生内膜肥厚[J];基础医学与临床;2010年12期
6 尚文斌;刘佳;于希忠;赵娟;;小檗碱对肥胖小鼠炎症因子分泌和炎症信号通路的作用[J];中国中药杂志;2010年11期
7 李颜;郭澄;;三黄泻心汤的现代药理研究进展[J];中国药房;2010年11期
8 周慧;马越鸣;石荣;闫晶超;;大鼠体内泻心汤及其不同配伍黄酮类成分药代动力学的变化规律研究[J];时珍国医国药;2009年09期
9 辛颖;耿慧春;张嵩;刘照振;马英丽;;三黄泻心汤及大黄中大黄酸在大鼠体内的药代动力学[J];中国实验方剂学杂志;2009年03期
10 耿慧春;辛颖;艾凤伟;马英丽;;三黄泻心汤HPLC指纹图谱研究[J];中草药;2008年04期
本文编号：
2894519
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zhongyaolw/2894519.html
