毛细管电泳法测定天麻素对乙酰胆碱酯酶活性的抑制

发布时间：2020-11-23 14:07

　　 阿尔茨海默症(AD)是引起中老年人痴呆最常见的疾病。目前治疗AD的药物主要为乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)。建立快速地从天然产物中筛选AChEI的方法,将对临床治疗AD产生积极的作用。该研究建立了一种简单可靠的AChEI筛选新方法。通过海美溴铵在毛细管内壁形成一段正电荷涂层,再经过离子吸附作用制备1.5 cm长的乙酰胆碱酯酶(AChE)反应器。底物碘化乙酰硫代胆碱在0.015 MPa压力下进样10 s,在微酶反应器中停留1 min后采用毛细管电泳(CE)法对底物和酶解产物进行分离。天麻素是天麻的重要药效成分之一,对AChE具有抑制作用。该研究以天麻素为例,根据加入药物前后酶解产物峰面积的差异,完成天麻素对AChE活性的抑制能力的测定。结果表明,随着天麻素浓度的增加,产物峰面积逐渐减小,对AChE的活性抑制变大。该方法所建微酶反应器产物峰面积的RSD值小于5.3%,可连续使用300次。当天麻素浓度为5.24μmol/L时,对AChE活性抑制率达到64.8%。根据加入不同浓度天麻素时的抑制率,测定出天麻素的IC_(50)值为(2.26±0.14)μmol/L(R~2=0.998 3)。与传统紫外分光光度法所得结果(2.09±0.18)μmol/L吻合较好。固定化酶微反应器的活性变差时,可以洗脱掉固定在柱上的AChE,重复酶的固定化步骤即可完成再生。该方法简单、高效,运行成本低,柱上固定的AChE酶反应器稳定性较好,可重复使用,极大地提高了工作效率,未来有望应用于各类AChEI的高通量筛选,对AD药物的研发具有积极作用。
【部分图文】：

熔融石英毛细管的内表面由于硅烷醇基团的电离而带有负电荷,AChE也带有负电荷。因此,必须通过具有强阳离子基团的水溶性电解质或聚合物来改性毛细管壁内壁,使其附着上正电荷,以制备固定化酶微反应器(见图1)。本研究采用0.1% HBD溶液进行内壁改性。实验结果表明,HBD改性得到的正电荷涂层足够稳定,可以承受运行缓冲液的多次冲洗。此外,带正电荷的涂层可以产生恒定的反向电渗流,可加速带负电荷分析物的迁移速度,实现更为快速的分离;涂层前后中性标记物N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的出峰时间由5 min延长至10 min,可知毛细管内壁正电荷改性成功。
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