基于宏基因组序列的黑熊肠道微生物组的应用基础研究

发布时间：2020-12-04 16:23

　　中药在我国医药产业的地位举足轻重,《中医药创新发展规划纲要（2006-2020年）》中明确提出,支持中药材珍稀濒危品种保护、繁育和替代品的研究。为开发名贵中药熊胆的人工替代品,科技部经过反复考察论证,立项重大新药创制“体外培育熊胆粉关键技术及临床前研究”（2014ZX09301306）。熊胆成分复杂,其中具有药学价值的主要成分为熊去氧胆酸,是通过肠道微生物中7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）和7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）,以鹅去氧胆酸为底物转化而来。黑熊作为能够大量产生熊去氧胆酸的特殊物种,研究其肠道微生物的结构与功能,并挖掘其中酶学性质优良的7α-/7β-HSDH,具有重要的科学意义和工业价值。然而,自然界中大多数微生物是不可培养的,动物肠道复杂的厌氧环境,更加限制了对其中微生物资源的开发。对环境样品进行宏基因组测序使得我们能够更快更好地了解其微生物组结构与功能,挖掘其中的功能基因。因此,本文基于宏基因组学的研究策略,采集来自四川、云南和黑龙江三个地区黑熊粪便样品,比较不同地区黑熊肠道微生物菌群的结构特征,揭示黑熊肠道微生物的共有微生物组成,解析黑熊肠道微生物组的基... 

【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 绪论
    1.1 课题的研究背景
    1.2 基于宏基因组学发现生物催化剂的研究现状
        1.2.1 土壤来源的宏基因组学生物催化剂发现
        1.2.2 海洋来源的宏基因组学生物催化剂发现
        1.2.3 肠道微生物来源的宏基因组学生物催化剂发现
    1.3 科学问题的提出及研究意义
    1.4 课题的研究内容与技术路线
        1.4.1 中国三地黑熊肠道微生物区系研究
        1.4.2 黑熊肠道宏基因组功能与代谢网络分析
        1.4.3 黑熊肠道微生物组来源的 7α-/7β-HSDHs的基因挖掘与克隆表征
        1.4.4 黑熊肠道微生物组来源的 7α-/7β-HSDHs的酶学性质研究
        1.4.5 研究的技术路线
    1.5 研究的创新点
2 黑熊肠道微生物菌群的区系研究
    2.1 引言
    2.2 材料与仪器
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 粪便采样
        2.3.2 总DNA提取及PCR扩增
        2.3.3 PCR产物的鉴定、纯化及定量
        2.3.4 数据优化
        2.3.5 OTU聚类
        2.3.6 分类学分析
        2.3.7 Alpha多样性分析
        2.3.8 Beta多样性分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 PCR扩增结果
        2.4.2 Alpha多样性分析及比较
        2.4.3 微生物区系组成及比较
        2.4.4 共有OTU分析
        2.4.5 菌群结构特征
        2.4.6 菌群LEfSe分析
    2.5 本章小结
3 黑熊肠道微生物组的宏基因组测序及解析
    3.1 引言
    3.2 材料与仪器
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 总DNA提取及片段化
        3.3.2 Hiseq文库的构建及测序
        3.3.3 测序数据的质控与拼接
        3.3.4 基因预测
        3.3.5 COG功能注释
        3.3.6 KEGG功能注释
        3.3.7 物种分类分析
        3.3.8 iPath代谢网络构建
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 宏基因组质控
        3.4.2 测序数据统计及优化
        3.4.3 ORF预测及分布
        3.4.4 COG注释及分布
        3.4.5 基于基因的物种分类
        3.4.6 iPath代谢网络
    3.5 本章小结
4 基于宏基因组数据的 7α-/7β-HSDH挖掘
    4.1 引言
    4.2 材料与仪器
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 7α-/7β-HSDH基因挖掘
        4.3.2 基因的克隆
        4.3.3 表达载体构建
        4.3.4 基因的表达纯化及浓度检测
        4.3.5 酶活测定
        4.3.6 高效液相色谱检测
        4.3.7 蛋白等电点及二级结构预测
        4.3.8 蛋白同源比对
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 目的基因发掘
        4.4.2 基因序列及电泳检测
        4.4.3 重组载体双酶切鉴定
        4.4.4 重组蛋白原核表达及纯化
        4.4.5 酶活检测结果
        4.4.6 产物检测结果
        4.4.7 蛋白的等电点与二级结构
        4.4.8 同源性及进化树分析
    4.5 本章小结
5 7α-/7β-HSDHs的酶学性质研究
    5.1 引言
    5.2 材料与仪器
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 实验仪器
    5.3 实验方法
        5.3.1 酶的表达与纯化
        5.3.2 动力学参数测定
        5.3.3 温度对酶活的影响
        5.3.4 pH对酶活的影响
        5.3.5 圆二色谱法测定Tm值
        5.3.6 基因必要性预测
        5.3.7 热稳定性研究
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 酶的动力学特征
        5.4.2 Tm值与基因必要性分析
        5.4.3 pH对酶的影响
        5.4.4 温度对酶的影响
        5.4.5 酶的热稳定性比较
    5.5 本章小结
6 全文总结及后续工作建议
    6.1 全文主要结论
        6.1.1 肠道微生物区系分布研究
        6.1.2 肠道微生物组功能结构及代谢网络研究
        6.1.3 7α-/7β-HSDH编码基因的克隆与验证
        6.1.4 7α-/7β-HSDH的酶学特性研究
    6.2 后续工作建议
7 文献综述
    7.1 介绍
    7.2 肠道微生物的形成与发展
    7.3 哺乳动物肠道微生物区系研究
    7.4 肠道微生物组与人类健康
    7.5 肠道微生物的全基因组测序
    7.6 结论与展望
致谢
参考文献
附录
    A. 攻读博士学位期间的研究成果
    B. 攻读博士学位期间参研的科研项目



本文编号：2897901