芒柄花素诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其氧化应激的机制
发布时间：2020-12-11 04:38
目的研究芒柄花素诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用及氧化应激机制。方法采用MTT法检测不同剂量的芒柄花素（8、16、32、64、128μmol·L-1）作用48 h后人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率; Annexin V/PI双染法流式细胞术检测MCF-7细胞的凋亡率; DCFH-DA荧光标记检测MCF-7细胞内活性氧（ROS）的水平; Rhodamine123探针染色分析芒柄花素及其联合NAC对MCF-7细胞线粒体膜电位（MMP）的影响; Western Blot法分析芒柄花素及其联合NAC对Bcl-2、Bax、caspase-3、JNK及P-JNK蛋白表达水平的影响;分光光度法测定MCF-7细胞内氧化应激相关的3种抗氧化酶:超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活力。结果芒柄花素能显著抑制MCF-7细胞的增殖,且呈剂量依赖性,48 h的IC50值为79.1μmol·L-1;随着芒柄花素剂量的增加凋亡率、ROS水平升高,膜电位降低,与对照组比较,联合ROS抑制剂NAC可显著拮抗此作用;与对照组比较,芒柄花素能下调MCF-7细胞内Bcl...
【文章来源】：华西药学杂志. 2020年04期 第385-391页
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
芒柄花素对MCF-7细胞增殖的抑制率
采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞的凋亡率。取对数生长期的MCF-7细胞，每孔1 m L接种于6孔板(每孔3×105个)中，每组设3个平行孔，培养24 h。每孔给药1 m L，阴性对照组加入培养基，阳性对照组加入2.4μmol·L-1表阿霉素，实验组分别加入39.5、79、158μmol·L-1芒柄花素，活性氧(ROS)抑制剂组先加入10 mmol·L-1NAC，培养1 h后再加入1 m L 79μmol·L-1芒柄花素，继续培养48 h后，收集各组细胞，于1×103r·min-1离心10 min，弃去上清液，用预冷的PBS重复洗涤两次。先加195μL AnnexinV-FITC结合液，轻轻重悬细胞，再依次加入5μL AnnexinV-FITC和10μL PI，轻轻混匀，在室温下避光孵育30 min后，置冰浴中，用300目筛网过滤，60 min内上流式细胞仪检测。如图2所示:与阴性对照组比较，随着芒柄花素剂量的增加，MCF-7细胞总凋亡率明显升高(P<0.01)。与79μmol·L-1芒柄花素组比较，芒柄花素联合NAC组的凋亡率显著低于芒柄花素组(P<0.01)。可推测芒柄花素诱导MCF-7细胞的凋亡作用与活性氧的升高有关。1.2.4 细胞内ROS水平的检测
采用流式细胞仪检测人乳腺癌MCF-7细胞的MMP。细胞接种、培养及给药同“1.2.3”项方法。给药后，继续培养24 h，收集各组细胞，加入500μL RPMI1640重悬细胞，避光加入Rhodamine 123溶液，使其终浓度为10μg·m L-1。于37℃下避光孵育20 min，离心收集细胞，PBS漂洗两次，用500μL PBS重悬。经300目筛网滤过后，用流式细胞仪在Ex488、Em530处检测荧光强度。测得各组细胞MMP的水平见图4。空白对照组为82.30%±0.38%，低剂量组为54.80%±0.77%，中剂量组为38.30%±0.93%，高剂量组为6.10%±1.69%，阳性对照组为40.70%±1.22%。抑制剂组为53.29%±2.35%。由表2可知:与对照组比较，随着芒柄花素剂量的增加，MMP逐渐降低，差异显著，抑制剂组显著低于中剂量组，表明芒柄花素能降低MCF-7细胞线粒体膜电位，且此作用与升高ROS有关。1.2.6 相关蛋白表达水平的检测
【参考文献】：
期刊论文
[1]鬼箭锦鸡儿中芒柄花素的薄层鉴别及总黄酮的测定[J]. 张玲玲,王楠轲,徐云,刘美君,王曙. 华西药学杂志. 2018(02)
[2]姜黄素对D-半乳糖致衰老大鼠氧化应激及Nrf2/ARE通路的影响[J]. 郭豫,赵建,赵江燕,姜招峰,张冬雪,黄汉昌. 华西药学杂志. 2016(03)
本文编号：2909919
【文章来源】：华西药学杂志. 2020年04期 第385-391页
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
芒柄花素对MCF-7细胞增殖的抑制率
采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞的凋亡率。取对数生长期的MCF-7细胞，每孔1 m L接种于6孔板(每孔3×105个)中，每组设3个平行孔，培养24 h。每孔给药1 m L，阴性对照组加入培养基，阳性对照组加入2.4μmol·L-1表阿霉素，实验组分别加入39.5、79、158μmol·L-1芒柄花素，活性氧(ROS)抑制剂组先加入10 mmol·L-1NAC，培养1 h后再加入1 m L 79μmol·L-1芒柄花素，继续培养48 h后，收集各组细胞，于1×103r·min-1离心10 min，弃去上清液，用预冷的PBS重复洗涤两次。先加195μL AnnexinV-FITC结合液，轻轻重悬细胞，再依次加入5μL AnnexinV-FITC和10μL PI，轻轻混匀，在室温下避光孵育30 min后，置冰浴中，用300目筛网过滤，60 min内上流式细胞仪检测。如图2所示:与阴性对照组比较，随着芒柄花素剂量的增加，MCF-7细胞总凋亡率明显升高(P<0.01)。与79μmol·L-1芒柄花素组比较，芒柄花素联合NAC组的凋亡率显著低于芒柄花素组(P<0.01)。可推测芒柄花素诱导MCF-7细胞的凋亡作用与活性氧的升高有关。1.2.4 细胞内ROS水平的检测
采用流式细胞仪检测人乳腺癌MCF-7细胞的MMP。细胞接种、培养及给药同“1.2.3”项方法。给药后，继续培养24 h，收集各组细胞，加入500μL RPMI1640重悬细胞，避光加入Rhodamine 123溶液，使其终浓度为10μg·m L-1。于37℃下避光孵育20 min，离心收集细胞，PBS漂洗两次，用500μL PBS重悬。经300目筛网滤过后，用流式细胞仪在Ex488、Em530处检测荧光强度。测得各组细胞MMP的水平见图4。空白对照组为82.30%±0.38%，低剂量组为54.80%±0.77%，中剂量组为38.30%±0.93%，高剂量组为6.10%±1.69%，阳性对照组为40.70%±1.22%。抑制剂组为53.29%±2.35%。由表2可知:与对照组比较，随着芒柄花素剂量的增加，MMP逐渐降低，差异显著，抑制剂组显著低于中剂量组，表明芒柄花素能降低MCF-7细胞线粒体膜电位，且此作用与升高ROS有关。1.2.6 相关蛋白表达水平的检测
【参考文献】：
期刊论文
[1]鬼箭锦鸡儿中芒柄花素的薄层鉴别及总黄酮的测定[J]. 张玲玲,王楠轲,徐云,刘美君,王曙. 华西药学杂志. 2018(02)
[2]姜黄素对D-半乳糖致衰老大鼠氧化应激及Nrf2/ARE通路的影响[J]. 郭豫,赵建,赵江燕,姜招峰,张冬雪,黄汉昌. 华西药学杂志. 2016(03)
本文编号：2909919
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